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眼眶淋巴瘤是指发生于眼睑、结膜、眼眶等眼附属器的恶性淋巴瘤。按病理组织特征可分为霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤两大类;按细胞来源分为B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、NK细胞淋巴瘤。眼眶淋巴瘤为结外组织淋巴瘤,绝大多数眼眶原发淋巴瘤为非霍奇金淋巴瘤。眼眶弥漫性大B细胞淋巴瘤(Diffuse large b-cell lymphoma,DLBCL)是眼眶高度恶性淋巴瘤,主要发生于成年人,恶性程度高、易复发、预后差。目前其治疗方法仍以手术、放疗、化疗相结合的综合治疗为主。但是,这些治疗手段存在副作用大且部分患者治疗效果差。随着对肿瘤发生发展机制的深入认识以及生物科技的突飞猛进,肿瘤治疗从传统的细胞毒药物治疗时代过渡到靶向治疗时代。靶向药物的应用使淋巴瘤治疗取得了突破性进展,效果好,不良反应小,但是目前的靶向药物仍无法对约40%DLBCL患者有效,因此需要对DLBCL发生机制进行进一步的研究、寻找潜在的新的治疗靶点,创新出更有针对性的药物。长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,LncRNAs)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA,具有重要的生物学功能,可参与基因印迹、染色质修饰、染色质重塑以及染色体沉默,也可参与转录激活、转录干扰和翻译调控等多重重要的调控过程。越来越多的证据表明,LncRNAs与细胞分化、增殖及许多人类疾病密切相关,LncRNAs与肿瘤的关系成为近年来研究的热点。Peng W等人研究发现在弥漫性大B细胞淋巴瘤肿瘤组织中HULC表达上调,而且通过Kaplan-Meier分析以及COX回归分析发现HULC的表达水平与患者预后差呈正相关。但是,HULC在DLBCL中的作用及分子机制研究尚不清楚。microRNA(miRNA)是细胞内长度约22nt的短单链内源性非编码RNA。通过与靶向mRNA结合抑制靶mRNA翻译或者直接降解,调控细胞的分化、增殖、凋亡。Shu YJ等人在胆囊癌中的研究,miR-29c-5p可以通过抑制CPEB4的表达来调控MAPK/ERK通路,进而发挥抑癌作用。新近研究发现LncRNA可通过吸附miRNA调控基因表达。生物信息学研究显示,HULC中含有miR-29c-5p的应答元件。因此推测,HULC可能通过吸附miR-29c-5p从而调控MAPK/ERK信号通路,并在眼眶DLBCL的发生发展中发挥重要作用。本研究拟在眼眶DLBCL中揭示一个新的HULC-miR-29c-5p调控路径,并分析其在眼眶DLBCL发生发展中的作用。目前关于LncRNAs与眼眶DLBCL发生发展的关系研究还很少,因此,在这方面进行研究,以深入了解LncRNAs在DLBCL发生发展中作用及机制,发现潜在的新的治疗靶点。本课题为研究HULC在眼眶DLBCL中的作用及机制,首先在临床上利用qRT-PCR检测了HULC和miR-29c-5p在眼眶DLBCL组织中的表达情况;然后,在体外,利用人弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系Pfeiffer构建了HULC敲除,miR-29c-5p和HULC过表达稳定细胞系,检测HULC敲除和HULC-miR-29c-5p axis对Pfeiffer细胞增殖、侵袭、凋亡以及MAPK/ERK通路的影响;最后体内研究,建立HULC敲除稳定细胞Pfeiffer淋巴瘤裸鼠模型,探讨了HULC敲除对DLBCL移植瘤生长的影响及机制。实验目的:1.检测HULC和miR-29c-5p在眼眶DLBCL组织中的表达情况2.研究HULC敲除和HULC-miR-29c-5p axis对DLBCL细胞增殖、侵袭、凋亡以及MAPK/ERK信号通路的影响。3.进一步研究HULC敲除对DLBCL移植瘤生长以及移植瘤中miR-29c-5p表达、细胞增殖、MAPK/ERK信号通路的影响。主要内容:第一部分 HULC和miR-29c-5p在眼眶DLBCL中的表达情况方法1.HE染色观察眼眶弥漫性大B细胞淋巴瘤的病理组织形态特征。2.利用qRT-PCR检测HULC和miR-29c-5p在眼眶DLBCL组织中的表达情况。结果1.HE染色发现眼眶弥漫性大B细胞淋巴瘤组织中肿瘤细胞弥散分布,体积大,呈圆形,核大,嗜碱性染色,核分裂像多见。2.与癌旁正常组织与反应性淋巴增生组织相比,在眼眶DLBCL组织中HULC表达明显上调,miR-29c-5p表达明显下调。第二部分 HULC对DLBCL细胞生物学功能的影响及分子机制方法1.构建pLenti-sh-HULC、pLenti-HULC以及pLenti-miR-29c-5p慢病毒载体。将构建好的慢病毒载体进行病毒包装和滴定,之后进行病毒感染Pfeiffer细胞,经筛选得到稳定转染细胞系。2.CCK-8、Transwell、流式细胞术实验检测Pfeiffer细胞增殖、侵袭以及凋亡情况。3.利用Western blot检测Pfeiffer细胞中MAPK/ERK信号通路相关蛋白p-MEK1/2、p-ERK的表达情况。4.利用qRT-PCR检测HULC和miR-29c-5p在外周血单个核细胞(PBMC细胞)和Pfeiffer细胞中的表达情况。5.生物信息学预测能与HULC结合的miRNA。双荧光素酶报告基因实验验证HULC与miR-29c-5p的关系。结果1.成功构建稳定sh-HULC和Lv-HULC Pfeiffer细胞系,用Lv-miR-29c-5p感染Lv-HULC Pfeiffer细胞得到miR-29c-5p+Lv-HULC细胞。2.HULC敲除能够抑制Pfeiffer细胞的增殖和侵袭,促进细胞凋亡,并能抑制MAPK/ERK信号通路的活性。3.与PBMC细胞相比,在Pfeiffer细胞中HULC表达明显升高,而miR-29c-5p表达明显降低。生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验均证明HULC和miR-29c-5p能相互结合,且HULC能够抑制miR-29c-5p的表达。4.HULC-miR-29c-5p axis可以通过影响MAPK/ERK信号通路的活性,进而调控Pfeiffer细胞的增殖、侵袭和凋亡。第三部分 HULC对DLBCL移植瘤生长的影响及分子机制方法1.利用HULC敲除的稳定细胞系Pfeiffer构建DLBCL淋巴瘤裸鼠模型,并检测HULC敲除对移植瘤体积和重量的影响。2.qRT-PCR检测DLBCL移植瘤中HULC和miR-29c-5p的表达情况。3.免疫组化检测HULC敲除对DLBCL移植瘤中Ki67表达的影响。4.Western blot检测DLBCL移植瘤中MAPK/ERK信号通路相关蛋白p-MEK1/2和p-ERK的表达情况。结果1.检测发现,HULC敲除可以抑制DLBCL移植瘤的生长。2.qRT-PCR检测发现,与对照组相比,HULC敲除组DLBCL移植瘤组织中HULC表达明显降低,miR-29c-5p表达明显升高。3.免疫组化检测发现,Ki67在HULC敲除组DLBCL移植瘤组织中的阳性表达率明显低于未敲除组。4.Western blot检测发现,与对照组相比,在DLBCL移植瘤中HULC敲除后p-MEK1/2和p-ERK表达明显降低。全文总结1.与癌旁正常组织与反应性淋巴增生组织相比,HULC在眼眶DLBCL组织中表达明显上调,而miR-29c-5p表达明显降低。2.与PBMC细胞相比,在Pfeiffer细胞中HULC表达明显升高,而miR-29c-5p表达明显降低。生物信息学预测和双荧光素酶报告基因实验均证明HULC和miR-29c-5p能相互结合,且HULC能够抑制miR-29c-5p的表达。HULC-miR-29c-5p axis可以通过影响MAPK/ERK信号通路的活性,进而调控Pfeiffer细胞的增殖、侵袭和凋亡。3.体内实验进一步表明,HULC敲除能够促进miR-29c-5p的表达,进而可能通过抑制MAPK/ERK信号通路的活性,抑制Pfeiffer裸鼠DLBCL移植瘤中癌细胞的增殖,从而抑制移植瘤的生长。