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目的:随着纳米技术的发展,纳米材料已被广泛应用到各个领域。对纳米材料生物学性能的研究已经成为进一步安全应用不可忽视的前提。目前研究表明,纳米颗粒能在不同水平上对机体器官产生影响,病理和细胞学水平研究结果发现纳米颗粒能够引起组织炎症反应,分泌炎性因子,同时产生氧化应激还能引起细胞的凋亡,但具体的机制尚不明确。本课题通过研究纳米陶瓷颗粒对免疫系统巨噬细胞的促凋亡作用和相关的信号途径和蛋白分子的改变,初步阐明纳米陶瓷颗粒诱导巨噬细胞凋亡效应及其相关机制。
材料与方法:首先建立大鼠腹腔巨噬细胞的激发增殖和收集纯化培养,以及用THP-1细胞株经佛波脂(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)诱导为巨噬细胞的技术条件,用RT-PCR方法鉴定特异性的CD 36抗原标志,在此基础上,在体外将(直径30-80nm)0ug/ml, 20ug/ml, 100ug/ml 羟基磷灰石(hydroxyapatite,Hap)和磷酸三钙(tricalcium phosphate,TCP)纳米颗粒与巨噬细胞共培养后,应用流式细胞仪,荧光染色的方法检测Hap和TCP纳米颗粒对巨噬细胞的凋亡作用,利用western blot方法检测凋亡相关的p53与Hsp70蛋白,以及p-JNK与p-c-jun等与应激凋亡产生有关的JNK/SAPK信号通路蛋白分子的表达。
结果:20ug/ml和100ug/ml的Hap和TCP纳米颗粒均能引起巨噬细胞的凋亡(P<0.001),且浓度较高的纳米颗粒引起巨噬细胞凋亡的程度也较高(P<0.05),TCP纳米颗粒引起巨噬细胞凋亡的百分率比Hap纳米颗粒高(P<0.001),western blot检测蛋白表达的结果显示:与对照组相比,Hap和TCP纳米颗粒能增加巨噬细胞p53,Hsp70,p-JNK, p-c-jun等蛋白表达(P<0.001),高浓度纳米颗粒引起蛋白表达较低浓度纳米颗粒高,且这些蛋白增高趋势相一致。TCP纳米颗粒刺激THP-1诱导的巨噬细胞p53表达较Hap纳米颗粒高(P<0.05)。
结论:Hap和TCP纳米陶瓷颗粒能引起巨噬细胞的凋亡,此效应与纳米颗粒的浓度有关;Hap和TCP纳米陶瓷颗粒能引起巨噬细胞中P53、Hsp70、p-JNK和p-c-jun等蛋白的表达增加,该现象与凋亡实验的结果相符合,由此提示p53与Hsp70蛋白在促进和调控巨噬细胞凋亡的发生中起着重要的作用,而JNK/SAPK信号途径可能是纳米陶瓷颗粒促巨噬细胞凋亡效应的信号传导途径之一。本研究在分子水平上为纳米陶瓷颗粒的生物安全性研究与评价提供了一些灵敏有效的检测技术。