研究目的胃肠道的正常功能对维持生命至关重要,与压力、肠道免疫系统以及衰老等因素密切相关。然而胃肠动力障碍是临床常见的疾病,包括食管动力障碍、胃食管反流病、功能性消化不良、胃瘫、慢性肠梗阻、术后肠梗阻、肠易激综合征、腹泻和便秘等。虽然已经开发了一些药物来治疗胃肠动力障碍,但收效甚微。胃肠动力障碍影响着全世界非常多的人群,导致严重的发病率和死亡率。目前对这些疾病的治疗是不够的,甚至没有缓解病人状况。因此,胃肠动力障碍在发达国家和发展中国家都产生了巨大且长期的社会和经济负担。胃肠动力的研究受到多种因素的影响。Cajal间质细胞(Interstitial cells of cajal,ICCs)是研究胃肠动力障碍性疾病的重要因素之一,它是一组存在于胃肠道的间质细胞,是胃肠道起搏细胞,同时也具有传导神经递质的作用。干细胞因子(Stemcell factor,SCF)及胃肠激素如胃促生长素(Ghrelin)、P物质(Substance P,SP)和内皮素(Endothelin,ET)均是参与胃肠动力的主要因素。而且SCF/Kit信号对ICCs的表型维持、增殖分化等有重要作用。胃肠激素参与胃肠道多种功能的调节,特别是胃肠动力方面。Ghrelin是由胃X/A样细胞分泌的一种生长激素促分泌素受体的内源性配体,目前为止,它是唯一可以在外周刺激食欲的激素。SP不但可刺激胃肠道运动和分泌胃肠激素,而且也可通过免疫细胞与神经分泌及因子相互作用,发挥着免疫调节作用。ET是目前所知收缩作用持续时间最长、作用最强的促进血管收缩和平滑肌细胞增殖的多肽物质。TLRs在很多胃肠疾病中都有表达,参与介导核因子kappa B(Nuclear factor kappa B,NF-κB)和c-Jun NH2-terminal激酶(c-Jun NH2-terminal kinase,JNK)信号通路,这些通路在胃肠动力相关疾病中的作用确实非常明确。研究发现,肠道菌群在胃肠动力疾病发病机制中起重要作用。益生菌是在摄入足够量时能够给宿主带来健康益处的活微生物,可以通过几种潜在的机制发挥作用,包括改变微生物组成、增强局部免疫反应和改善肠道屏障功能。酪酸梭菌(Clostridium Butyricum,C.Butyricum)是一种严格厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌,因其能产生大量酪酸而得名,除具有促进肠道微生态平衡、维护肠道生物屏障作用外,还可双向调节胃肠动力。但是C.Butyricum对于胃肠动力障碍的相关调控机理尚不明确。因此,本课题以C.Butyricum和ICCs为实验素材,通过体外实验观察C.Butyricum对小鼠ICCs中TLR2、IL-6以及IL-8表达水平的影响,在此基础上深入探究C.Butyricum对于TLR2、SCF以及胃肠激素中Ghrelin、SP和ET分泌的调控;并通过检测NF-κB和JNK信号通路相关因子p65、p-p65、IκBα、p-IκBα、JNK、p-JNK、c-Jun和p-c-Jun表达水平的变化,研究C.Butyricum对胃肠动力的调控机理,以期为C.Butyricum在胃肠动力疾病的治疗中提供一种新的研究方向。研究方法本研究以ICCs细胞和C.Butyricum为研究材料。剪取BALB/C小鼠的一段小肠获得ICCs并鉴定。C.Butyricum培养在MRS培养基,28℃厌氧环境下生长。细胞处理实验前,收集细菌,悬浮在无抗生素的1640培养基,浓度为1×108 CFU/ml。将细胞置于2 ml 1640培养基中或指定浓度1×108 CFU/ml的C.Butyricum悬液中,放在37℃、含5%CO2培养箱中孵育2 h。在C.Butyricum对小肠ICCs中TLR2、IL-6和IL-8关系的研究中,用1×108CFU/ml的C.Butyricum对ICCs细胞处理2小时后,采用反转录定量聚合酶链式反应(Reverse Transcription quantity Polymerase Chain Reaction,RT-q PCR)分别检测对照组和C.Butyricum实验组中TLR2、IL-6和IL-8的m RNA表达水平;使用Western blot检测对照组和C.Butyricum实验组中TLR2、IL-6和IL-8的蛋白质表达水平。为检验C.Butyricum通过ICCs中的TLR2调控IL-6和IL-8的表达,实验中在si-TLR2或si NC转染ICCs之后,用RT-q PCR检测si NC和si-TLR2组中TLR2、IL-6和IL-8的m RNA水平;用蛋白印迹法检测si NC和si-TLR2组中TLR2、IL-6和IL-8的蛋白质表达水平。在C.Butyricum促进ICCs增殖和调控胃肠激素的分泌的研究中,为了研究TLR2沉默后对ICCs细胞活性、SCF、Ghrelin、SP和ET分泌的影响,实验在si-TLR2或si NC转染ICCs后,采用CCK-8法检测si NC和si-TLR2组中ICCs细胞活性;采用RT-q PCR检测si NC和si-TLR2组中SCF的m RNA表达含量,采用Western blot检测si NC和si-TLR2组中SCF的蛋白质表达含量;采用酶联免疫吸附(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒检测si NC和si-TLR2组中Ghrelin、SP和ET的蛋白质表达水平。在C.Butyricum通过TLR2激活NF-κB和JNK信号通路的研究中,为了研究TLR2沉默后对NF-κB和JNK信号通路的影响,在si-TLR2或si NC转染或C.Butyricum处理ICCs后,采用Western blot分别检测si NC+Control组、si NC+C.Butyricum组、si-TLR2+Control组以及si-TLR2+C.Butyricum组的ICCs中NF-κB信号通路核心因子(p65、p-p65、IκBα和p-IκBα)以及JNK信号通路核心因子(JNK、p-JNK、c-Jun和p-c-Jun)的蛋白表达水平。研究结果在C.Butyricum对小肠ICCs中TLR2、IL-6和IL-8关系的研究中,RT-q PCR实验结果显示,与对照组比较,实验组TLR2(p<0.001)、IL-6(p<0.001)和IL-8(p<0.001)m RNA表达水平均显著升高。Western blot检测显示,与对照组相比,实验组TLR2(p<0.001)、IL-6(p<0.001)和IL-8(p<0.001)的蛋白质水平表达均显著上调。同时,ICCs转染si-TLR2或si NC后,与对照组相比,转染si-TLR2的ICCs中TLR2的m RNA表达水平及蛋白表达水平均明显下降(p<0.01),表明转染效率高,可以进行下一步实验。随后在研究C.Butyricum通过ICCs中的TLR2调控IL-6和IL-8的表达的实验结果中发现,与si NC+Control组相比,si NC+C.Butyricum组中IL-6(p<0.001)和IL-8(p<0.001)的m RNA水平明显提升;与si-TLR2+Control组相比,si-TLR2+C.Butyricum组中IL-6(p<0.01)和IL-8(p<0.01)的m RNA水平也明显提升;而与si-NC+C.Butyricum组相比,si-TLR2+C.Butyricum组中IL-6(p<0.05)和IL-8(p<0.05)的m RNA表达水平均明显降低。Western bolt也显示与si NC+Control组相比,si NC+C.Butyricum组中IL-6和IL-8的蛋白条带信号明显变强;与si-TLR2+Control组相比,si-TLR2+C.Butyricum组中IL-6和IL-8的蛋白条带信号明显变强;而与si-NC+C.Butyricum组,si-TLR2+C.Butyricum组中IL-6和IL-8的蛋白条带信号明显变弱。在C.Butyricum促进ICCs增殖、SCF以及调控胃肠激素的分泌的研究中,对ICCs增殖的研究发现,与si NC+Control组相比,si NC+C.Butyricum组中,细胞活力明显增加(p<0.05);与si TLR2+Control组相比,si TLR2+C.Butyricum组中,细胞活力明显增加(p<0.05);与si NC+C.Butyricum组相比,si TLR2+C.Butyricum组中,细胞活力明显降低(p<0.05),表明通过si RNA转染细胞敲低TLR2后,ICCs细胞活力明显降低。对C.Butyricum调控胃肠激素的分泌的研究发现,与si NC+Control组相比,si NC+C.Butyricum组中,SCF的m RNA表达水平明显增加(p<0.01);与si TLR2+Control组相比,si TLR2+C.Butyricum组中,SCF的m RNA表达水平明显增加(p<0.05);与si NC+C.Butyricum组相比,si TLR2+C.Butyricum组中,SCF的m RNA表达水平明显降低(p<0.01)。SCF在各组中的蛋白质表达水平具有同样的趋势,不管在si NC组还是C.Butyricum组,只要C.Butyricum处理后,与Control相比,SCF的蛋白质表达水平也显著升高,但在TLR2受到抑制后SCF的蛋白质表达水平明显降低。除此之外,在si NC组和C.Butyricum组中,与Control相比,C.Butyricum也促进Ghrelin和SP的分泌(p<0.05);当与si NC+C.Butyricum组相比时,si TLR2+C.Butyricum组中,C.Butyricum诱导的Ghrelin和SP的分泌明显降低(p<0.05)。对于ET分泌变化的研究发现,si NC+Control组与si NC+C.Butyricum组相比以及si TLR2+Control组与si TLR2+C.Butyricum组相比均显示,加入C.Butyricum前后,两组ET分泌无明显变化;而si NC+C.Butyricum组与si TLR2+C.Butyricum组相比,TLR2沉默对ET分泌也无显著影响。在C.Butyricum通过TLR2激活NF-κB和JNK信号通路的研究中,对NF-κB信号通路核心因子的研究发现,与si NC+Control组相比,si NC+C.Butyricum组中,p65和IκBα的磷酸化表达均明显增加;同样,与si TLR2+Control组相比,si TLR2+C.Butyricum组中,p65和IκBα的磷酸化表达均明显增加。与si NC+C.Butyricum组相比,si TLR2+C.Butyricum组中,p65和IκBα的磷酸化表达明显降低。同时无论TLR2沉默与否,无论C.Butyricum处理与否,对p65和IκBα的表达基本无影响。对JNK信号通路核心因子的研究发现,与si NC+Control组相比,si NC+C.Butyricum组中,JNK和c-Jun的磷酸化表达均明显增加;同样,与si TLR2+Control组相比,si TLR2+C.Butyricum组中,JNK和c-Jun的磷酸化表达均明显增加。与si NC+C.Butyricum组相比,si TLR2+C.Butyricum组中,JNK和c-Jun的磷酸化表达明显降低。同时无论TLR2沉默与否,无论C.Butyricum处理与否,对JNK和c-Jun的表达基本无影响。研究结论及意义1、C.Butyricum调控ICCs中TLR2、IL-6和IL-8的表达,且通过TLR2调节IL-6和IL-8的表达。2、C.Butyricum增加ICCs的细胞活性,提高胃肠激素的表达,且通过TLR2调节上述变化。3、ICCs中,C.Butyricum通过调控TLR2对NF-κB和JNK信号通路产生影响。4、C.Butyricum很可能通过对Cajal细胞及胃肠激素的影响实现对胃肠动力学的调控作用。C.Butyricum作为一种益生菌,已经在调整人体肠胃微生物种群等方面得到应用,但是其对胃肠动力学的内在调控机制尚不明确。本文创新性地揭示了C.Butyricum对Cajal细胞以及胃肠激素分泌的影响,探究得出了其中可能的内在机理,不仅丰富了C.Butyricu应用中的基础性研究,为C.Butyricum在胃肠动力研究中的调控作用提供一种理论研究基础,而且还为胃肠动力疾病的临床治疗提供一种新的思路和方向。