论文部分内容阅读
药用植物资源是人类健康的物质基础。伴随着合成药物和抗生素的滥用，越来越多的毒副作用也随之而来，因此，更为安全可靠的植物来源药物在全世界范围内得到重视。因此，开发大量的分子标记，对于研究药用植物的资源评价、保育遗传学分析、活性成分遗传规律具有重要意义，是药用植物安全可持续利用的基础。本研究利用转录组学和生物信息学技术，开发了四种药用植物（枸杞、淫羊藿、银叶树和乌拉尔甘草）的分子标记，并将这些标记应用到枸杞遗传图谱构建，以及淫羊藿、银叶树和乌拉尔甘草的自然居群遗传结构分析中。 1.枸杞是中国传统名贵中药材之一，以其丰富的健康促进生物活性成分而得到广泛的重视。迄今为止，还没有利用分子标记构建遗传图谱和分子标记辅助育种的报道。本研究基于黑果枸杞[Lycium ruthenicum Murr.(LR)]和枸杞[L.chinense Mill.(LC)]转录组开发了分子标记。经过从头拼接，从LR和LC中分别得到40，769和50，351条unigenes，用于开发SNP(Single nucleotidepolymorphism)和SSR(Simple sequence repeat)标记。在LR和LC中，我们分别搜索到了1，118个和1，374个潜在的EST-SSR标记。来自于黑果枸杞的975个SSR标记用来进行验证，其中766个（占78.6％）在黑果枸杞中得到成功扩增，并且561个SSR标记在宁夏枸杞[L.barbarum Linnaeus(LB)]中得到扩增，跨物种扩增率为73.2％(561/766)。通过将黑果枸杞测序reads比对到枸杞unigenes上，共搜索到66，862个SNP位点，其中62.8％为置换，37.2％为颠换。本研究中随机选取96个SNP位点进行SNP的验证和跨物种可转移性检验。SNP检验使用的模板是分别来源于LR、LC和LB的三个DNA池（每个DNA池包含10个单株）。其中92个SNP位点至少在一个DNA池中得到扩增，79个位点通过Sanger测序得到了验证。这是枸杞属植物中第一次报道EST来源的SNP和SSR标记，这些标记将成为研究枸杞居群遗传学、构建遗传图谱和分子育种的重要资源。同时，通过与番茄基因组的比对分析，我们开发了一批内含子长度多态性（Intron-length polymorphism，ILP）标记。利用上述得到的SSR标记、ILP标记和一个宁夏枸杞杂交群体（94个个体），我们构建了枸杞属第一张遗传图谱，该图谱总图距为634.3 cM，包含24个连锁群、127个标记位点（115个SSR标记和12个ILP标记）。连锁群平均长度为26.4 cM，标记间平均间距为4.99 cM。估算宁夏枸杞基因组大小为1，038.2cM，基因组覆盖度61.1％。 2.淫羊藿属是小檗科的一个属，该属有大约十个种被用于中国传统中药。在本研究中，我们利用箭叶淫羊藿454转录组测序获得了1，761个潜在的SNP位点。我们随机选取38个位点用Sanger测序法进行验证。其中28个位点得到了扩增，21个（占55％）SNP位点被成功确认。根据这个比例，大约会有900个多态性SNP标记会被开发出来。在这些确认的SNP位点中，15个被成功转化为CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequences)或dCAPS(derived-CAPS)标记。三个淫羊藿自然群体被用来测试这些标记的遗传多样性参数。结果表明，这15个标记中的14个为多态性标记。这些标记的观测杂合度范围为0.000到1.000，期望杂合度范围为0.000到0.529。遗传多态性信息指数范围为0.000到0.375。这些SNP标记将有效地促进淫羊藿居群遗传学、物种鉴定和分子育种等后续研究工作。 3.银叶树是一种重要的红树林树种，同时也是一种重要的药用植物。近年来，由于野生资源的过度开采和人类活动对银叶树栖息地的破坏，它已经被国际自然保护联盟红色名录列为濒危物种。在本研究中，我们从银叶树454转录组测序数据中鉴定了1，393个潜在的SNP位点和433个潜在的SSR标记。我们选择36个SNP位点，用CAPS方法进行验证，其中19个为多态性标记。同时，在随机选取的24个SSR位点中，16个为多态性SSR标记。同时，我们利用两个银叶树自然群体，测试了这些分子标记的遗传参数。本研究是首次对于银叶树SNP和SSR标记的报道，这些分子标记将极大促进银叶树的遗传多样性研究，并进一步促进银叶树的遗传保育工作。 4.乌拉尔甘草属于豆科甘草属植物，是一种重要的传统药用植物。近年来，由于野生资源的过度开采和人类活动对其栖息地的破坏，导致野生甘草资源的锐减，甘草属的乌拉尔甘草、光果甘草和胀果甘草已被中国濒危物种科学委员会列入国家重点保护野生药材物种名录。本研究利用公共数据库中发表的乌拉尔甘草转录组数据，鉴定了30，030个潜在的SNP位点。我们选择了60个SNP位点并转化为CAPS标记，用CAPS方法在两个乌拉尔甘草野生群体中进行验证，其中41个标记可以得到稳定的扩增，31个为多态性标记。这些SNP位点在两个群体中的遗传参数如下:观测杂合度范围为0.056到1.000和0.071到1.000，期望杂合度范围分别为0.053到0.500和0.069到0.500。平均遗传多态性信息分别为0.247和0.262。本研究是首次对于甘草SNP标记的报道，这些分子标记将极大促进甘草属植物的遗传多样性研究和遗传保育工作。