论文部分内容阅读
DVT是骨科大手术后常见的临床并发症,属于静脉回流障碍性疾病,发病率高,危害性大,是骨科手术患者围手术期死亡的重要原因之一。DVT发病机制复杂,涉及内皮细胞、血小板、白细胞等多方面因素,近年来研究表明,血管内皮细胞损伤,是静脉血栓形成最重要的原因之一,内皮细胞损伤后可释放各种粘附分子、血小板活化因子、组织因子,增强凝血,促进DVT形成;然而,氧化应激反应、炎症反应是引起静脉内皮细胞损伤的常见原因,氧化应激、炎症可引起机体活性氧、炎症因子产生增加,使细胞脂质过氧化、NO减少,从而引起内皮细胞损伤、凋亡,促进DVT形成;同时,有研究表明,NF-κB可以通过上调组织因子表达,促进凝血,从而影响DVT形成;许多研究表明,白藜芦醇具有抗氧化、抗炎、保护内皮细胞损伤的功能,但是,在DVT形成方面却罕见报道。因此,本研究旨在探讨:白藜芦醇对内皮细胞氧化损伤、凋亡的抑制作用,以及对促血栓分子P-Selectin、vWF表达的影响及调控机制。[目的]1.探讨白藜芦醇对内皮细胞氧化损伤、凋亡的影响。2.探讨白藜芦醇对内皮细胞损伤后促血栓分子P-Selectin、vWF表达的影响及调控机制。[方法]本研究分为两部分:1.第一部分,本实验部分分为三组:(1)空白对照组;(2)H202组:以20μmo/L的H202处理人脐静脉内皮细胞24小时建立静脉内皮细胞损伤模型;(3)RES+H2O2组:以30μmo/L的白藜芦醇预处理HUVECs 2小时后,再以200μmo/L的H202处理细胞24小时。采用MTT法检测各组细胞活力,以探讨白藜芦醇对H202诱导的HUVECs损伤的保护作用;采用荧光探针DCFH-DA捕获法、激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧ROS含量,以探讨白藜芦醇对内皮细胞氧化应激的影响;Hoechst 33258染色法、荧光显微镜,AnnexinV-FITC/PI双染法、流式细胞仪检测细胞凋亡,以探讨白藜芦醇对内皮细胞凋亡的影响。2.第二部分,本实验部分分为四组;(1)空白对照组;(2)H202组:本组与第一部分相同;(3)RES+H2O2组:本组与第一部分相同;(4)BAY11-7082+H2O2组:以5μmol/LNF-κB特异性抑制剂BAY 11-7082预处理细胞4小时后,再加入 200μmol/L H2O2 孵育细胞 24 小时。采用 Real-Time PCR、western blot检测各组NF-κB、P-Selectin、vWF基因及蛋白表达变化,以探讨白藜芦醇对内皮细胞损伤后促血栓分子P-Selectin、vWF表达的影响及调控机制。[结果]1.第一部分实验结果:采用200μmol/L的H2O2处理HUVECs 24小时,即H202组,与对照组相比,细胞活力明显降低(P<0.01),细胞内ROS含量明显增多(P<0.01),细胞凋亡率明显增加(P<0.01);然而采用30μmo/L白藜芦醇预处理HUVECs 2小时后,再用200μmo/L H202孵育细胞24小时,即RES+H2O2组,与H202组相比,细胞活力明显增高(P<0.01),细胞内ROS含量明显减少(P<0.01),细胞凋亡率明显减少(P<0.01)。2.第二部分实验结果:(1)用200μmol/L H202处理HUVECs 24小时后,即H202组,其NF-κB、P-Selectin、vWFmRNA及蛋白表达较对照组明显增高(P<0.01)。(2)然而在加入了 NF-κB的特异性抑制剂BAY 11-7082 5μmol/L预处理4小时后,再用200μmol/LH2O2处理细胞24小时,即BAY11-7082+H2O2组,与H2O2组比较,其NF-κBmRNA及蛋白表达出现了下调(P<0.01),P-Selectin、vWFmRNA及蛋白表达也随之下调(P<0.05)。(3)而在加入30μmol/L的白藜芦醇预处理2小时后,再用200μmol/LH2O2处理细胞24小时,即RES+H2O2组,与H2O2组比较,其NF-κBmRNA及蛋白表达出现了下调(P<0.01),P-Selectin、vWFmRNA及蛋白表达也随之下调(P<0.05)。(4)RES+H2O2组与 BAY 11-7082+H2O2组比较,BAY 11-7082+H2O2组NF-κB mRNA及蛋白表达下调更明显(P<0.01),vWFmRNA及蛋白表达下调也更明显(P<0.01)。[结论]1.白藜芦醇可减少内皮细胞损伤、凋亡。2.白藜芦醇可减少内皮细胞损伤后ROS生成。3.NF-κB参与了内皮细胞损伤后促血栓分子P-Selectin、vWF表达。4.白藜芦醇可以抑制内皮细胞损伤后促血栓分子P-Selectin、vWF的激活,且可能通过NF-κB信号通路发挥效应;推测其对DVT形成具有一定的防治作用。