应激是机体对内部或外界各种刺激所产生的一种非特异性应答反应的总和。适度应激能够促使人体进行合理的自我心理和生理状态的调整,有助于提高机体的适应能力和活动效率。然而过强的应激或者长期慢性应激状态,均会累及我们的心身健康和生活质量。面对同样或相类似的应激因素,不同的个体表现出的适应能力是不同的,这与身体素质、健康状况、个人经历以及对待事物的不同评价等相关,即为应激反应的个体差异性及主观性。已经证实,老化个体更容易患有神经系统退行性疾病,同时,机体内环境的变化可以波及大脑对应激的反应。那么,脑老化伴随的一系列脑组织结构和功能变化是否会促使机体对应激的反应更加强烈?应激造成的认知功能下降是否受到脑老化的影响,其机制有哪些?虽然大量研究探索了应激反应对脑功能的影响,但慢性应激与老化和认知功能的关系及相关机制仍需要进一步探究。不可预知性慢性温和应激(UCMS)是研究应激相关机制较为理想的模型,采用多种不同的心理和/或环境应激源,模拟与人类环境相似的应激状况,是目前比较常用和公认的模型。连续数周的慢性应激可使动物表现出应激相关的各种病理性表现,包括情绪、神经内分泌、神经化学以及行为学等方面的变化。SAMP8小鼠表现为较早出现的认知下降(快速老化),并出现与阿尔茨海默病类似的神经病理改变,是研究老化较为理想的模型。SAMR1小鼠无快速老化的相关特征,通常作为SAMP8的对照组。Morris水迷宫测试和新异物体识别实验是较为经典的测定啮齿类动物认知功能的实验方法,分别用于评价与海马相关的空间及情景记忆等方面的认知功能变化。突触可塑性在出生后随着发育逐渐变化,成年时相对稳定,老年阶段缓慢退化。海马的突触可塑性在学习和记忆的形成、神经变性性疾病的发展过程中起到了重要的作用。海马区突触结构和功能的变化可导致认知功能的改变。因此,海马突触可塑性可视为脑老化相关认知功能障碍的神经生物学基础。氟西汀是一种选择性的5-羟色胺再摄取抑制剂,主要用于抑郁症的治疗。已有研究报道,氟西汀可以对抗神经元毒性,有效促进神经元的分化,提高突触可塑性,具有神经保护作用,改善认知功能障碍。本课题组前期亦有研究结果显示,氟西汀对于应激后成年SD大鼠的认知功能及抑郁情绪具有改善作用,而氟西汀对于应激后老龄SAMP8小鼠认知功能的影响还未有报道。本课题采用SAMP8小鼠和SAMR1小鼠作为研究对象,观察不可预知性慢性温和应激对快速老化小鼠和老化抵抗小鼠的神经病理学、学习记忆能力、突触结构可塑性的影响,并进一步探讨SSRI药物氟西汀对于应激后相关认知功能障碍的治疗作用,并探讨相关机制。第一部分 慢性应激对SAMP8小鼠认知功能和神经超微结构的影响目的:观察不可预知性慢性温和应激对SAMR1和SAMP8小鼠的神经病理学和学习记忆能力的影响,明确快速老化小鼠和老化抵抗小鼠的大脑对应激的耐受力是否存在差异。方法:1采用6月龄雄性SAMR1及SAMP8小鼠,随机分为四组:1)R1(SAMR1小鼠不接受应激处理);2)UCMS+R1(SAMR1小鼠接受应激处理);3)P8(SAMP8小鼠不接受应激处理);4)UCMS+P8(SAMP8小鼠接受应激处理)。UCMS处理连续4周,建立慢性应激模型。2记录在应激操作开始前和4周的应激操作结束后行为学开始前的体重,分别记录为应激前和应激后的体重,反应小鼠的整体状态。3完成4周的慢性应激后,采用新异物体识别实验和Morris水迷宫实验观察各组小鼠的认知功能。4行为学实验后通过透射电子显微镜观察各组小鼠海马CA1区神经元及突触的超微结构。结果:1应激操作开始前,两组SAMR1小鼠之间的体重无明显差异(P>0.05),两组SAMP8小鼠之间的体重无明显差异(P>0.05)。应激结束后,SAMR1小鼠与SAMR1应激组小鼠之间体重无明显差异(P>0.05);与SAMP8组的小鼠相比,UCMS+P8组小鼠体重明显下降(P<0.05)。以上结果表明,慢性应激对SAMR1小鼠的体重无明显影响,慢性应激后SAMP8小鼠的体重下降。2新异物体识别实验结果显示,在1小时和24小时的时间测试各组小鼠对两个物体的总触碰时间没有明显的差异(P>0.05)。在1小时和24小时测试结果显示,SAMR1小鼠与SAMR1应激组小鼠的认知指数相比无明显差异(P>0.05);SAMP8组的小鼠的认知指数与SAMR1小鼠相比降低(P<0.05),同时,与SAMP8组的小鼠相比,UCMS+P8组小鼠的认知指数明显下降(P<0.05)。3 MWM水迷宫实验评价了各组小鼠海马依赖性的空间学习记忆能力。定位巡航实验结果显示,R1组和UCMS+R1组小鼠的逃避潜伏期无显著的差异(P>0.05)。与R1组小鼠相比,P8组小鼠的逃避潜伏期明显延长(P<0.05)。然而,慢性应激进一步增加了延长的逃避潜伏期(P<0.05,UCMS+P8 vs P8组)。在空间探索实验中,我们撤去水下隐形平台。R1组和UCMS+R1组小鼠的穿越平台次数无显著差异(P>0.05)。与R1组小鼠相比,P8组小鼠穿越平台的次数明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。UCMS+P8组小鼠的穿越平台次数进一步减少(P<0.05,UCMS+P8 vs P8组)。上述结果说明SAMP8小鼠的老化因素导致了其的认知功能下降,而慢性应激进一步加剧了SAMP8小鼠的认知功能障碍,而本实验采用的应激方案对SAMR1小鼠的认知功能无明显影响。4透射电子显微镜观察了各组小鼠之间海马CA1区神经元和突触超微结构的差异。SAMR1组小鼠海马神经元细胞膜清晰可见,细胞质基质及核糖体分布均匀,线粒体膜及线粒体嵴结构清晰完整,粗面内质网呈现片层状或管泡状,高尔基复合体由单层膜构成4-8个平行排列的扁囊,中间形成囊腔,细胞核核质分布均匀;突触数量较多,突触前膜、后膜及间隙结构清晰,突触之间的链接部位明显,突触小泡数量丰富。UCMS+R1组小鼠海马神经元较SAMR1组无明显改变,细胞基质内偶尔可见脂肪滴及脂褐素;UCMS+R1组小鼠与SAMR1组比较,突触结构无明显改变。SAMP8组小鼠海马神经元细胞膜尚完整,细胞质基质及核糖体分布尚均匀,线粒体嵴膜部分融合,粗面内质网轻度肿胀,部分高尔基复合体膜结构模糊,细胞核和核膜结构尚完整,细胞质和胞核出现水肿;突触结构欠清晰,偶尔可见突触前末端肿胀。UCMS+P8组小鼠海马神经元细胞膜模糊不清,细胞质出现水肿,基质不均匀,线粒体、内质网、高尔基复合体等各种细胞器数量均减少,线粒体嵴膜融合严重,粗面内质网脱颗粒。胞核内染色质边集、核膜模糊。突触前膜肿胀并破坏,突触后膜增厚,突触间隙模糊。第二部分 慢性应激对SAMP8小鼠突触可塑性相关标志物的影响目的:观察SAMR1及SAMP8小鼠海马部位突触可塑性相关标志物的蛋白和m RNA水平的表达,从而探讨慢性应激后相关的分子生物学机制,明确SAMP8小鼠应激耐受力下降的原因。方法:1动物分组及模型制备同第一部分。2蛋白印迹(Western blotting)实验方法观察各组小鼠海马PSD95、SYN、BDNF和Trk B蛋白水平的表达。3 RT-PCR实验方法观察各组小鼠海马PSD95、SYN、BDNF和Trk B m RNA的表达。结果:1慢性应激对小鼠海马PSD95和SYN蛋白和m RNA水平的影响。与SAMR1小鼠相比,SAMP8小鼠海马PSD95和SYN蛋白的表达降低(P<0.05)。R1组和UCMS+R1组小鼠海马PSD95和SYN蛋白的表达无显著差异,应激对SAMR1小鼠海马突触可塑性相关蛋白的表达无明显影响(P>0.05)。与P8组相比,UCMS+P8组小鼠海马PSD95和SYN蛋白表达水平进一步降低(P<0.05)。RT-PCR结果与Western blotting类似。PSD95和SYN m RNA在SAMR1组海马的表达明显高于SAMP8小鼠,差异有统计学意义(P<0.05)。与P8组小鼠相比,UCMS+P8组小鼠海马PSD95和SYN m RNA的表达明显下降(P<0.05),而R1组和UCMS+R1组之间海马m RNA的表达无明显差异。结果显示UCMS后SAMP8小鼠海马PSD95和SYN m RNA及蛋白的表达下降。2慢性应激对小鼠海马BDNF和Trk B蛋白的影响。与SAMR1小鼠相比,SAMP8小鼠海马BDNF和Trk B蛋白的表达降低(P<0.05)。R1组和UCMS+R1组小鼠海马BDNF和Trk B蛋白的表达没有显著的差异,应激对SAMR1小鼠海马BDNF和Trk B蛋白的表达无明显影响(P>0.05)。与P8组相比,UCMS+P8组小鼠海马BDNF和Trk B蛋白表达水平进一步降低(P<0.05)。RT-PCR结果与Western blotting类似。BDNF和Trk B m RNA在SAMR1组海马的表达明显高于SAMP8小鼠,差异有统计学意义(P<0.05)。与P8组小鼠相比,UCMS+P8组小鼠海马BDNF和Trk B m RNA的表达明显下降(P<0.05),而R1组和UCMS+R1组之间海马m RNA的表达无明显差异。结果表明UCMS后SAMP8小鼠海马BDNF和Trk B m RNA及蛋白的表达下降。第三部分 氟西汀对慢性应激后SAMP8小鼠认知功能的影响及相关机制探讨目的:利用UCMS小鼠模型研究SSRI药物氟西汀对于应激后相关认知功能障碍的治疗作用,并探讨相关机制。方法:1采用6月龄雄性SAMR1及SAMP8小鼠,随机分为四组:1)R1组(SAMR1小鼠不接受应激处理);2)P8组(SAMP8小鼠不接受应激处理);3)UCMS组(SAMP8小鼠接受应激处理);4)Flu组(应激的SAMP8小鼠接受氟西汀治疗)。2慢性不可预知性温和应激(UCMS)的干预及药物治疗UCMS组小鼠接受随机排列的低强度的社会和环境应激源的应激处理,每天随机挑选2-3种应激源,连续应激6周。应激源同第一部分。氟西汀用0.9%氯化钠配置成终浓度2mg/ml。应激2周后,氟西汀组的小鼠接受氟西汀腹腔注射,每周7天,连续治疗4周,氟西汀使用量为20mg/kg(10ml/kg)。其它组小鼠接受同等量的生理盐水腹腔注射。3记录在应激操作开始前和应激6周的应激操作结束后(氟西汀治疗结束后)行为学开始前的体重,分别记录为应激前和应激后的体重,反应小鼠的整体状态。4氟西汀治疗结束后,采用蔗糖偏爱实验观察各组小鼠的抑郁状态,Morris水迷宫实验观察各组小鼠的认知功能。5行为学实验后通过透射电子显微镜观察各组小鼠海马CA1区神经元及突触的超微结构。6蛋白印迹(Western blotting)实验方法观察各组小鼠海马PSD95、SYN、BDNF和Trk B蛋白水平的表达及Bcl-2和Bax蛋白的表达。7 RT-PCR实验方法观察各组小鼠海马PSD95、SYN、BDNF和Trk B m RNA的表达。结果:1应激操作开始前,各组SAMP8小鼠之间的体重无明显差异(P>0.05)。应激后,与SAMP8组的小鼠相比,UCMS组小鼠体重明显下降(P<0.05);与UCMS组小鼠,Flu组小鼠的体重明显增多(P<0.05)。以上结果说明,慢性应激使SAMP8小鼠体重减轻,而给予氟西汀治疗后小鼠体重增加。2蔗糖饮水实验:与P8组相比,UCMS组小鼠的蔗糖偏爱值明显下降(P<0.05);与UCMS组相比,Flu组小鼠的蔗糖偏爱值明显增多,差异有统计学意义(P<0.05)。上述结果说明慢性应激导致了SAMP8小鼠抑郁样状态的产生,而氟西汀的治疗改善了其抑郁表现。3 MWM水迷宫实验评价了各组小鼠海马依赖性的空间学习记忆能力。定位巡航实验结果显示,与R1组小鼠相比,P8组小鼠的逃避潜伏期明显延长(P<0.05)。然而,慢性应激进一步增加了延长的逃避潜伏期(P<0.05,UCMS vs P8组),与UCMS组相比,Flu组小鼠的逃避潜伏期缩短(P<0.05)。在空间探索实验中,我们撤去水下隐形平台。与R1组小鼠相比,P8组小鼠穿越平台的次数明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05);接受慢性应激处理的SAMP8小鼠的穿越平台次数进一步减少(P<0.05,UCMS+P8 vs P8组);与UCMS组相比,Flu组小鼠的穿越平台次数明显增多(P<0.05)。上述结果说明慢性应激进一步加剧了SAMP8小鼠的认知功能障碍,而氟西汀的治疗改善了其认知功能的损伤。4氟西汀治疗改善了慢性应激后SAMP8小鼠脑内海马CA1区神经元及突触的受损情况。5与SAMR1小鼠相比,SAMP8小鼠海马PSD95和SYN蛋白和m RNA的表达降低(P<0.05);与P8组相比,UCMS组小鼠海马PSD95和SYN蛋白和m RNA的表达水平进一步降低(P<0.05);与UCMS组相比,Flu组小鼠海马PSD95和SYN蛋白和m RNA的表达水平升高(P<0.05)。结果说明UCMS降低了SAMP8小鼠海马PSD95和SYN蛋白和m RNA的表达,而氟西汀治疗逆转了应激后蛋白和m RNA表达的变化。6与SAMR1小鼠相比,SAMP8小鼠海马BDNF和Trk B蛋白和m RNA的表达降低(P<0.05);与P8组相比,UCMS组小鼠海马BDNF和Trk B蛋白和m RNA的表达水平进一步降低(P<0.05);与UCMS组相比,Flu组小鼠海马BDNF和Trk B蛋白和m RNA的表达水平升高(P<0.05)。结果说明UCMS降低了SAMP8小鼠海马BDNF和Trk B蛋白和m RNA的表达,而氟西汀治疗逆转了应激后BDNF和Trk B蛋白和m RNA表达的变化。7氟西汀对各组小鼠海马凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达的影响。与SAMR1小鼠相比,SAMP8小鼠海马Bcl-2蛋白的表达降低(P<0.05);与P8组相比,UCMS组小鼠海马Bcl-2蛋白表达水平进一步降低(P<0.05);与UCMS组相比,Flu组小鼠海马Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05)。与SAMR1小鼠相比,SAMP8小鼠海马Bax蛋白的表达增多(P<0.05);与P8组相比,UCMS组小鼠海马Bax蛋白表达水平进一步增多(P<0.05);与UCMS组相比,Flu组小鼠海马Bax蛋白表达水平降低(P<0.05)。结果说明UCMS后SAMP8小鼠海马Bcl-2蛋白的表达降低,海马Bax蛋白表达升高,而氟西汀治疗逆转了慢性应激后蛋白表达的变化。结论:1 SAMP8小鼠与SAMR1小鼠相比,其认知功能下降,神经元及突触超微结构受损。行为学及电镜结果显示,连续4周的慢性不可预知性温和应激对SAMR1小鼠的认知功能、神经元及突触超微结构无明显影响,却导致SAMP8小鼠的认知障碍加重,伴随着神经元及突触超微结构严重受损。说明慢性不可预知性温和应激对两种小鼠的认知功能及神经病理的影响并不相同,6月龄SAMR1小鼠对慢性应激具有良好的调控力,而同月龄SAMP8小鼠的应激耐受力则出现明显下降,提示老化的个体应激耐受力下降,对应激的损伤更加敏感。2与6月龄的SAMR1小鼠相比,同月龄的SAMP8小鼠接受慢性不可预知性温和应激后,海马突触相关蛋白、BDNF-Trk B的表达进一步减少。在内源性因素(老化)和外源性因素(UCMS作用)的共同作用下,老化小鼠表现出对应激的耐受力降低,海马突触可塑性及BDNF-Trk B信号通路受损可能是慢性应激后SAMP8小鼠认知功能下降的相关神经生物学机制。我们的研究加强了对老年个体慢性应激相关认知功能损害的认识,可能为认知功能障碍或痴呆的有效防治提供更多的理论依据。3本研究利用氟西汀治疗改善了慢性应激后SAMP8小鼠的抑郁状态及认知功能障碍,同时改善了其海马神经元和突触的超微结构。氟西汀发挥神经保护作用的生物学机制是多通路的。氟西汀治疗提高了慢性应激后SAMP8小鼠突触相关蛋白的表达,海马突触结构可塑性的改善和凋亡途径的抑制可能是氟西汀治疗改善应激后SAMP8小鼠认知功能损伤的潜在机制。同时BDNF-Trk B信号通路的激活可能在氟西汀治疗改善慢性应激后SAMP8小鼠突触可塑性和抑制凋亡途径的过程中发挥重要作用。这些研究为慢性应激后认知功能障碍的治疗提供了更多依据。