花生溶血磷脂酸酰基转移酶基因的克隆和功能初步研究

来源 :中山大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:LKYWGF
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
花生是重要的油料作物之一,其种子含有丰富的脂肪酸。脂肪酸代谢调控过程中关键酶基因的分离和克隆使得利用遗传基因工程手段改良脂肪品质成为可能,采用基因工程手段有望获得稳定高产、目的脂肪酸含量丰富、满足各种需求的植物脂肪酸,具有巨大的应用前景和经济价值。   溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)是控制代谢过程中溶血磷脂酸形成不同的磷脂酸的流向的关键酶。本文根据植物溶血磷脂酸酰基转移酶保守的氨基酸序列,通过比对同源性较高的区域,设计改良的简并引物进行PCR,从花生cDNA文库中钓取出一个LPAAT基因cDNA片段,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得该cDNA的3和5序列,从而得到全长为1561个碱基的cDNA序列,分析表明该序列具有一个长度为1131bp,编码376个氨基酸的开放阅读框(ORF),生物信息学分析表明该氨基酸序列具有保守的酰基转移酶结构域,将该基因的的氨基酸序列进行比对分析发现其与蓖麻LPAAT(Ricinus communis putative lysophosphatidic acid acyltransferaseLPAAT GenBank:ACB30546.1)的氨基酸同源性为90%,和油桐(Vernicia fordiiputative glycerol-3-phosphate acyltransferase GenBank:ACT32030.1)同源相似性为90%,故将其任命为AhLPAA T(Arachis hypogaea Lysophosphatidic AcidAcyltransferase)。并且我们还克隆了该基因的DNA序列(全长为3822bp),到目前为止,这是花生中第一次成功进行溶血磷脂酸酰基转移酶基因的克隆。   将AhLPAAT的氨基酸序列与各物种进行同源分析,并运用MEGA软件构建系统发育树。序列分析表明该基因的蛋白编码区含有三个跨膜结构域,一个酰基转移酶功能结构域。我们在大肠杆菌pGEX4T-1原核表达体系中进行诱导表达获得AhLPAAT基因及其截断基因的蛋白表达产物,纯化蛋白并成功制备了抗体。利用RT-PCR结合qRT-PCR深入研究分析该AhLPAAT在花生各组织中的表达模式。利用洋葱瞬时表达体系研究AhLPAAT基因表达产物的亚细胞定位,初步表明该蛋白定位在质膜上。   运用温度敏感LPAAT缺陷型大肠杆菌JC201进行温度互补实验,阴性结果表明该AhLPAAT不能互补大肠杆菌JC201的功能缺失,初步判断AhLPAAT不是一类质体LPAAT;利用本实验室的高效种子特异表达启动子(AhOleo17.8)和CaMV35S与克隆出来的AhLPAAT基因cDNA序列构建过表达载体转化拟南芥,获得转基因T1种子,通过分析cDNA序列克隆其中一段含有酰基转移酶保守区段以及和拟南芥中AT5G60620同源性较高的区段构建植物干扰载体,拟通过分析植物过表达和植物干扰载体转化沉默后的拟南芥脂肪酸组分的变化,来分析AhLPAAT在脂肪酸代谢途径中的重要功能。
其他文献
  凡纳滨对虾是我国乃至世界养殖产量最高的对虾品种,培育生长快的对虾新品种对于推动对虾养殖业的发展具有重要的意义。利用高密度遗传连锁图谱定位生长性状相关的QTL位点,
  自2009年凡纳滨对虾早期综合死亡症(EMS)爆发以来,养殖成功率连年降低。针对钦州地区春、秋、冬季海水盐度较高,一般在10度左右,而夏季海水盐度趋于0度的特殊环境条件,为探索
会议
  在节肢动物中,维甲酸X受体(RXR)是一类非常保守的核受体超家族,它与蜕皮激素受体形成的异源二聚体对很多生理过程是至关重要的。但是与蜕皮激素受体相比,RXR相关信号通路
乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase,GO)可以催化乙醇酸氧化生成乙醛酸。本课题通过对土壤微生物与一些植物的筛选,首次发现黄花苜蓿(Medicago.falcata Linn)中存在高活力的乙醇酸
本文对乙烯氧化生产环氧乙烷的生产放大和工艺技术路线进行了阐述,并对目前国内采用的乙烯氧气直接氧化生产环氧乙烷的SD与SHELL工艺技术路线进行了比较分析。为消化吸收国外
  顶体架构体(acroframosome,AFS)是真虾类精子形成中出现的细胞骨架结构,目前日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)、秀丽白虾(Exopalaemon modestus)、罗氏沼虾(Macrobra
会议
本论文在综述国内外高吸水树脂合成及应用文献的基础上,采用微波辐射工艺将丙烯酸和丙烯酰胺接枝到瓜尔胶主链上,通过适度交联,制备了吸水性能较好的高吸水树脂。讨论了制备
2010年4月27日上午,华平股份在深圳交易所创业板挂牌上市了。作为一名见证上海华平信息技术股份有限公司发展历程的人,非常荣幸地应华平股份董事长刘焱女士的邀请,与华平股份
  三疣梭子蟹是重要的海洋甲壳动物,目前全国养殖面积40万亩左右,养殖产量超过10万t.三疣梭子蟹卵巢雌雄性腺发育不同步,卵巢在交配后发育成熟.现有研究表明,未交配三疣梭
  对虾白斑综合症病毒(white spot syndromevirus,WSSV)是一种有囊膜的双链环状DNA病毒,是线头病毒科(Nimaviridae)白斑病毒属(Whispovirus)的唯一物种,可以引起对虾的白斑