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花生是重要的油料作物之一,其种子含有丰富的脂肪酸。脂肪酸代谢调控过程中关键酶基因的分离和克隆使得利用遗传基因工程手段改良脂肪品质成为可能,采用基因工程手段有望获得稳定高产、目的脂肪酸含量丰富、满足各种需求的植物脂肪酸,具有巨大的应用前景和经济价值。
溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)是控制代谢过程中溶血磷脂酸形成不同的磷脂酸的流向的关键酶。本文根据植物溶血磷脂酸酰基转移酶保守的氨基酸序列,通过比对同源性较高的区域,设计改良的简并引物进行PCR,从花生cDNA文库中钓取出一个LPAAT基因cDNA片段,再根据获得的部分序列设计基因特异性引物,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得该cDNA的3和5序列,从而得到全长为1561个碱基的cDNA序列,分析表明该序列具有一个长度为1131bp,编码376个氨基酸的开放阅读框(ORF),生物信息学分析表明该氨基酸序列具有保守的酰基转移酶结构域,将该基因的的氨基酸序列进行比对分析发现其与蓖麻LPAAT(Ricinus communis putative lysophosphatidic acid acyltransferaseLPAAT GenBank:ACB30546.1)的氨基酸同源性为90%,和油桐(Vernicia fordiiputative glycerol-3-phosphate acyltransferase GenBank:ACT32030.1)同源相似性为90%,故将其任命为AhLPAA T(Arachis hypogaea Lysophosphatidic AcidAcyltransferase)。并且我们还克隆了该基因的DNA序列(全长为3822bp),到目前为止,这是花生中第一次成功进行溶血磷脂酸酰基转移酶基因的克隆。
将AhLPAAT的氨基酸序列与各物种进行同源分析,并运用MEGA软件构建系统发育树。序列分析表明该基因的蛋白编码区含有三个跨膜结构域,一个酰基转移酶功能结构域。我们在大肠杆菌pGEX4T-1原核表达体系中进行诱导表达获得AhLPAAT基因及其截断基因的蛋白表达产物,纯化蛋白并成功制备了抗体。利用RT-PCR结合qRT-PCR深入研究分析该AhLPAAT在花生各组织中的表达模式。利用洋葱瞬时表达体系研究AhLPAAT基因表达产物的亚细胞定位,初步表明该蛋白定位在质膜上。
运用温度敏感LPAAT缺陷型大肠杆菌JC201进行温度互补实验,阴性结果表明该AhLPAAT不能互补大肠杆菌JC201的功能缺失,初步判断AhLPAAT不是一类质体LPAAT;利用本实验室的高效种子特异表达启动子(AhOleo17.8)和CaMV35S与克隆出来的AhLPAAT基因cDNA序列构建过表达载体转化拟南芥,获得转基因T1种子,通过分析cDNA序列克隆其中一段含有酰基转移酶保守区段以及和拟南芥中AT5G60620同源性较高的区段构建植物干扰载体,拟通过分析植物过表达和植物干扰载体转化沉默后的拟南芥脂肪酸组分的变化,来分析AhLPAAT在脂肪酸代谢途径中的重要功能。