论文部分内容阅读
邻苯二甲酸酯（Phthalate esters;PAEs）是一类环境激素类物质,其毒性效应及机制、生态风险和健康风险已受到广泛关注。研究发现,PAEs可致生物体生殖能力受损并影响后代发育。目前,PAEs对水生生物的生殖毒性研究较少,且侧重于单一PAEs暴露,而实际水体存在多种PAEs的复合暴露,PAEs复合暴露对水生生物的生殖毒性及作用机制亟待研究。因此,本文在研究镇江主要河流中典型PAEs的污染水平、来源分布及生态风险的基础上,以斑马鱼为模式生物考察邻苯二甲酸二丁酯（DBP）和邻苯二甲酸二异丁酯（DiBP）复合暴露的生殖毒性;利用转录组测序技术结合形态学、病理学等分子生物学方法,探讨DBP和DiBP复合暴露的潜在生殖毒性作用机制,为PAEs污染物的生态及健康风险提供理论依据。主要研究内容如下:（1）镇江主要河流中PAEs的污染水平、来源分布及其生态风险研究。采用固相萃取（SPE）和气相色谱-质谱（GC-MS）联用方法测定丰水期和枯水期运粮河、古运河和京杭大运河的水样、悬浮颗粒样（SPM）和沉积物样中六种典型PAEs（DMP、DEP、DiBP、DBP、DEHP和DOP）的含量。结果表明,六种PAEs（Σ6PAEs）在水样、SPM和沉积物样中的含量分别为2.6539.31μg/L、1.9734.10μg/g、0.9334.70μg/g;水样中DiBP、DBP和DEHP为主要污染物,沉积物和SPM样中DiBP、DEHP和DOP为主要污染物。丰水期,Σ6PAEs在水和SPM中的Kd1为0.0043.36 L/g,Σ6PAEs在水和沉积物中的Kd2为0.001-9.75 L/g;枯水期,Σ6PAEs的Kd1为0.122.84L/g,Σ6PAEs的Kd2为0.0068.05 L/g。多变量统计分析显示,PAEs可能来源于生活污水和工业废水的排放。生态风险熵（RQ）评估表明,水样中DBP具有中等风险（0.01<RQ<1）,DiBP和DEHP则具有高风险（RQ>1）;沉积物样中DiBP具有高风险（RQ>1）。可见,六种PAEs的分布无显著季节性差异,DBP和DiBP在水样、SPM样和沉积物样中同时存在,具有潜在暴露风险。（2）DBP和DiBP复合暴露对成年雄性斑马鱼的生殖毒性及其作用机制研究。血浆性激素测定结果表明,复合暴露的睾丸激素（T）水平高于DBP和DiBP单一暴露。精巢病理分析显示,与单一暴露相比,复合暴露不仅诱导精子数量减少还导致细胞间隙扩大。转录组测序发现,复合暴露的精巢中有4570个差异表达基因（DEGs）,DBP和DiBP单一暴露的DEGs分别为2795个和1613个;GO功能注释发现,与生殖相关DEGs复合暴露有25个,DBP和DiBP单一暴露分别有10个和5个;KEGG分析显示,单一暴露和复合暴露均可作用于细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路,其区别在于复合暴露还作用于类固醇激素合成、视黄醇代谢、PPAR信号通路和细胞外基质受体相互作用信号通路。可见,DBP和DiBP复合暴露对雄性斑马鱼具有生殖毒性,其可能是通过作用于细胞因子-细胞因子受体相互作用、类固醇激素合成、视黄醇代谢、细胞外基质受体相互作用和PPAR信号通路产生生殖毒性。（3）DBP和DiBP复合暴露对成年雌性斑马鱼的生殖毒性及其作用机制研究。卵巢病理分析表明,DBP和DiBP单一暴露可诱导卵母细胞膜和滤泡细胞层之间接触丧失,且晚期/成熟卵母细胞（LO）的占比分别显著降低至17.3%和16.2%,复合暴露的卵巢未发现病变。血浆性激素测定结果表明,DBP和DiBP单一暴露的雌二醇（E2）水平分别显著降低38.9%和41.0%,复合暴露的E2水平则无显著变化。卵巢转录组分析显示,DBP和DiBP单一暴露的DEGs分别为3135个和3645个,复合暴露的DEGs为2564个;GO功能注释发现,DBP和DiBP单一暴露的生殖相关DEGs分别为16个和27个,复合暴露的生殖相关DEGs为13个;KEGG分析显示,单一暴露以及复合暴露均作用于神经活性配体-受体相互作用、促性腺激素释放激素、孕激素介导的卵母细胞成熟、卵母细胞减数分裂和类固醇激素生物合成信号通路,其区别在于单一暴露还作用于胆碱代谢、细胞外基质-受体相互作用和细胞粘附信号通路。可见,DBP和DiBP复合暴露对雌性斑马鱼在分子水平上表现出潜在的生殖毒性。（4）亲本DBP和DiBP复合暴露对斑马鱼子代的早期发育毒性及作用机制研究。结果表明,亲本单一暴露和复合暴露均诱导斑马鱼子代的早期发育指标（心率、孵化率、死亡率、畸形情况）产生显著变化;亲本单一暴露斑马鱼的产卵量显著下降,亲本复合暴露无显著变化。转录组学分析显示,亲本DBP和DiBP单一暴露子代的DEGs分别为701个和1492个,亲本复合暴露子代的DEGs为139个;GO功能注释发现,亲本单一暴露和复合暴露均出现与视觉发育相关的DEGs,其区别在于DBP单一暴露的DEGs还涉及代谢、氧化还原和固醇转运,DiBP单一暴露的DEGs还涉及聚合物细胞骨架纤维、收缩纤维和各种酶活性;KEGG分析显示,亲本DBP和DiBP单一暴露均作用于光转导信号通路,其区别在于亲本DBP单一暴露还作用于脂肪消化吸收、蛋白质消化吸收和维生素消化吸收信号通路,亲本DiBP单一暴露还作用于蛋白酶体、昼夜节律和胆汁分泌信号通路。可见,亲本复合暴露可影响子代的眼部发育,其可能的作用机制是通过干扰视觉感知相关基因的表达产生毒性。综上,DBP、DiBP单一和复合暴露对成年斑马鱼均有生殖毒性且具有性别差异,复合暴露对雄性斑马鱼的生殖毒性高于雌性斑马鱼。亲本DBP和DiBP复合暴露对斑马鱼子代的早期发育毒性与DBP和DiBP复合暴露对雌性斑马鱼的生殖毒性一致,均低于单一暴露。转录组学分析推测DBP和DiBP复合暴露通过改变与生殖相关信号通路中关键基因的表达水平而产生生殖毒性,亲本DBP和DiBP复合暴露通过影响子代早期发育过程中与视觉感知相关基因的表达水平而影响子代眼部发育。