方剂现代研究一直是中医药研究领域的重点和难点。复方作用于人体的生物效应模式是中药复方机制研究的关键问题之一,利用中医方剂的配伍优势及其多成分、多靶点、多途径调节的特点,探索中药复方特有的效应模式,对于揭示中医方剂的理论内涵有重要的意义。本课题基于葛根黄芩黄连汤临床用于2型糖尿病治疗的经验背景,选择分别来自于该方中4味中药所涉及的四种化学成分及其配伍作为该方成分配伍的表征,以体外3T3-L1脂肪细胞IR模型为工具,在观察各单体成分不同浓度对该模型细胞糖消耗或摄取影响的基础上,进一步考察其效阈下的低或极低浓度单体配伍的抗IR效应,以探讨中药复方多成分低浓度下的生物效应模式。论文分文献综述和实验研究两部分。文献综述部分主要总结了方剂现代实验研究、葛根黄芩黄连汤及其方内药味所含主要单体的实验研究和药理研究及其临床运用、IR细胞模型的研究进展。实验研究部分首先建立稳定的细胞系,确定四种中药单体的安全有效浓度,继之复制3T3-L1细胞IR模型,探查各单体低浓度条件下作用于模型细胞的浓度-效应,最后进行四种单体阈浓度的配方及阈下浓度各单体交互配伍的研究。研究一：3T3-L1前脂肪细胞的分化诱导及四种中药单体对细胞活力的影响3T3-L1前脂肪细胞的分化诱导方法：从-80℃冰箱中取出含有前脂肪细胞的冻存管,迅速放37℃水浴锅内复温融化,复苏。将3T3-L1前脂肪细胞,用含10%小牛血清的高糖-DMEM,在37℃5%CO2条件培养,48h换培养液,传代。取对数(指数)生长期的传代细胞冻存。细胞接种于培养板,待其生长至完全融合后2D,采用诱导剂I BMX、DEX、Ins诱导分化。取不同分化时间中的3T3-L1细胞,显微镜下观察其形态变化和细胞油红0着染情况。结果：复苏后贴壁培养的3T3-L1前脂肪细胞为梭形,均匀分散分布于培养瓶底部,大小形态一致,增殖稳定快速,生长曲线呈“S”形；分化期间细胞开始由梭形逐渐向椭圆、类圆及圆形转变,胞体逐渐增大,胞浆丰富；油红0染色显示培养中3T3-L1前脂肪细胞脂滴不断增多,D9-D10,90%以上的细胞胞浆中积聚大量的脂滴,脂滴呈红色,胞核呈蓝色,大量体积较大的脂滴分布于细胞核周围,形成典型的成熟脂肪细胞形态“戒环样”结构。结果表明前脂肪细胞的诱导分化成功。四种中药单体对3T3-L1细胞活力的影响方法：将3T3-L1前脂肪细胞以1×104细胞/孔,接种于无菌96孔培养板中,200μL/孔,待细胞完全贴壁,吸弃上清液,设置空白对照组和不同浓度药物干预组(10-3～10μM),药物干预48h后,MTT实验检测各组的OD值。结果：葛根素10-1、1.0μM浓度、黄芩素10-1～10μM、小檗碱10-2～1.0μM、甘草酸10-1～10μM浓度组的OD值均见显著升高,小檗碱10μM组的OD值显著降低。表明四种单体较低浓度区间均有增加细胞活力的作用。研究二：3T3-L1细胞IR模型建立及4种中药单体对IR模型细胞的影响3T3-L1细胞IR模型的建立方法：将分化成熟的3T3-L1细胞的96孔细胞培养板中,加入0.2%BSA的DMEM培养基培养12h后,分为正常对照组和IR模型组。正常组以含0.2%BSA的DMEM培养基培养,模型组以含0.2%BSA.10-6M INS的DMEM培养基培养,孵箱内培养24h、48h后,氧化酶法和荧光(2-NBDG)标记法测定各组细胞培养液中葡萄糖量和细胞葡萄糖摄取量。结果：较之于对照组,模型组24h和48h细胞外液中糖量显著性增加,细胞糖摄取量显著性降低。表明经高胰岛素诱导24h和48h的3T3-L1细胞的糖消耗或摄取降低,具有IR特征,模型复制成功。中药单体对IR模型细胞糖消耗或摄取的影响方法：96孔细胞培养板中正常对照组和IR模型组3T3-L1细胞,分别以含0.2%BSA的DMEM培养基和含0.2%BSA、10-6M Ins的DMEM培养基培养24h；模型组再分成模型对照和药物干预各组。正常组以含0.2%BSA的DMEM培养基,模型组和药物干预各组分别以含10-6M Ins的DMEM培养基和含10-6M Ins+不同浓度的中药单体的培养基,分别培养24h和48h后,氧化酶法测定各组细胞培养液葡萄糖量或／和细胞葡萄糖摄取量。结果：较之于对照组,模型组24h和48h细胞外液的葡萄糖量明显增加；较之于模型组,葛根素10-3、10-2、10-1μM24h釉10-3、10-1M48h细胞外液的糖量均明显减少,黄芩素10-4～1μM24h和10-5～1μM48h细胞外液的葡萄糖量均明显增加,小檗碱10-2、10-、1μ M24h和10-4～1μM48h细胞外液的葡萄糖量均明显增加,甘草酸10-4～1μ M24h和10-5～1μM48h细胞外液的葡萄糖量均明显增加。表明多个低浓度区间的4种单体作用IR脂肪细胞24h和48h均有显著增加其糖消耗的作用,具有抗IR活性。研究三：效阈浓度下四种单体配伍对IR模型细胞的效应观察四种单体配方对IR模型细胞糖消耗的影响方法：取以上各单体的阈浓度组合成复方,进一步稀释成含不同浓度的10-6M Ins的DMEM培养基。细胞分组及培养同研究二。于含药培养基作用24h和48h,采用氧化酶法分别测定各组细胞培养液葡萄糖量。结果：较之于对照组,模型组24h和48h细胞外液葡萄糖量增加；较之于模型组,四种单体配方各浓度(10-5μM～1.0μM)24h和48h细胞外液葡萄糖量显著性减少。表明四种单体阈浓度配方105μM-1.0μM均有抗IR活性。效阈浓度下4种单体不同配伍对IR模型细胞糖摄取的影响方法：取各单体阈浓度的1/10,按4因素2水平正交表组合成不同配方,稀释成含药浓度为1／40的10-6M Ins的DMEM培养基。细胞培养同研究二。于含药培养基作用24h和48h,2-NBDG荧光标记法分别测定各组细胞葡萄糖摄取量。结果：与正常组比较,模型组24h和48h细胞糖摄取量显著减少；较之于模型组,4种单体不同配伍中的多组配方24h和48h细胞糖摄取量明显增加,其48h的效应优于24h,4种单体合用配方24h和48h细胞糖摄取量均明显高于其他各组。表明极低浓度下的4种成分配方较其他拆方配伍具有更好的抗IR活性。各因素交互关系分析表明,影响24h和48h的药物效应的主要因素分别是甘草酸和黄芩素、甘草酸、葛根素,提示甘草酸和黄芩素在全方中发挥重要作用。本课题基于复杂系统理论对中药复方可能存在多成分极低浓度下的生物效应模式进行探讨,结果在细胞水平上发现效阈浓度下(微量)的多种单体配方具有明显的生物效应。本研究对于“中药复方低浓度下多成分相互作用产生效应”的推测提供实验证据。