论文部分内容阅读
前言microRNAs(miRNAs)是一类内源性非编码小RNAs,广泛存在于各种生物体内,miRNA通过降解目的mRNA或抑制其翻译调控基因表达,参与调控多种生物学功能。研究表明有些miRNAs通过调控与细胞凋亡、增殖和侵袭相关的信号传导因子,影响肿瘤细胞的凋亡、增殖和侵袭。研究发现mir-125a在乳腺癌和肺癌细胞中低表达,但其是否参与调控肺癌细胞凋亡、增殖和侵袭等生物学功能目前尚不清楚。本实验研究mir-125a对肺癌细胞凋亡、增殖和侵袭的作用及其可能的机制。材料与方法1、细胞系人支气管上皮细胞HBE,肺腺癌细胞A549、SPC-A-1和LTEP-a-2,肺鳞癌细胞SK-MES-1和QG56,人肺巨细胞癌细胞BE1,大细胞肺癌细胞NCL-H661和NCL-H460,小细胞肺癌细胞NCL-H446。2、miRNA序列正义mir-125a序列:5’-UCC CUG AGA CCC UUU AAC CUG UG-3’;反义mir-125a序列:5’-CAC AGG UUA AAG GGU CUC AGG GA-3’;乱序miRNA序列:5’-GGA CGG CGA UCA GAU AAG AGU UC-3’。每个碱基都进行了2’-O甲基化修饰以保持RNA序列的稳定性,无荧光标记。3、细胞培养10%或15%胎牛血清的DMEM或RPMI-1640培养,37℃、5%CO2。4、实时定量聚合酶链反应(real time PCR)提取细胞总RNA,根据TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit试剂盒和TaqMan?MicroRNA Assays HSA-MIR-125A说明书在Applied Biosystems7900HT Fast Real-Time PCR System操作。以U18为对照,所有反应均设置三个复孔。实验结果用RQ Manager 1.2分析。5、瞬时转染培养细胞至亚融合状态,将正义mir-125a、反义mir-125a和乱序miRNA溶液(20μM)和LipofectamineTM2000混合液加入到孔板中。37℃、5%CO2条件下培养4~6小时后换液。根据需要培养24到72小时。6、流式细胞术(Annexin V-FITC双染法)每种细胞分成四个小组:空白对照组、加Annexin V组、加FITC组和加AnnexinV+FITC组。在BD FACSCaliburTMFlow Cytometer上检测细胞凋亡情况。7、Western Blot采用考马斯亮蓝法进行蛋白定量。ECL显色。Westernblot实验结果经凝胶成像系统采集,进行灰度值测定,以β-actin为内对照。8、Transwell侵袭小室转染24h后,在上室加入100μl无血清培养基稀释的细胞(2.5×105个/mL)(6h前铺胶),下室加入600μl含血清的培养基,37℃、5%CO2条件下培养。24h后苏木素染色,镜下观察、计数。9、噻唑兰(MTT)法连续检测5天,6个复孔。用酶联免疫检测仪测量各孔在490nm处的吸光值,根据吸光值绘制细胞增殖曲线。10、统计学分析应用SPSS13.0统计分析软件,对细胞实验结果采用t检验进行数据分析,用mean±SD表示,P<0.05为有统计学意义。结果1、9种不同类型肺癌细胞中仅SK-MES-1中mir-125a的表达高于HBE细胞(p=0.008),其余均低于HBE细胞,其中A549、NCL-H661、NCL-H460和SPC-A-1降低比较明显(p<0.01)。2、转染正义mir-125a的A549细胞中成熟mir-125a表达明显高于未处理组细胞(P=0.004);转染反义mir-125a的A549细胞中成熟mir-125a表达明显低于未处理组细胞(P=0.005)。3、转染正义mir-125a能促进A549细胞凋亡、抑制其侵袭;转染反义mir-125a能抑制A549细胞凋亡、增强其侵袭能力;正义和反义mir-125a对A549细胞的增殖无明显影响。4、转染正义mir-125a的A549细胞野生型P53表达约是未处理组细胞的7倍,转染反义mir-125a的A549细胞野生型P53表达比未处理组细胞低40%。转染正义mir-125a的A549细胞经野生型P53抗体封闭后,细胞早期凋亡率明显低于单纯转染组,约下降50%;但仍高于未处理组。这一结果提示正义mir-125a可能通过上调p53促进A549细胞凋亡。结论除SK-MES-1外,其余8种肺癌细胞中mir-125a表达均低于HBE细胞;mir-125a既能抑制肺癌细胞侵袭,又能通过上调P53蛋白促进肺癌细胞凋亡。mir-125a抑制肺癌细胞侵袭机制有待进一步研究。