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目的:以人乳腺癌细胞株MCF-7为研究对象,通过转染DEDD-sh RNA建立稳定干扰DEDD表达的MCF-7细胞株,对比性研究DEDD基因在MCF-7细胞肿瘤耐药中的作用,并阐明DEDD在调节乳腺癌耐药中的作用机制,为乳腺癌的治疗提供新的策略和实验依据。方法:1野生型(wild type,WT)人乳腺癌MCF-7购买于中国医学科学院&北京协和医学院细胞中心,MCF-7 control sh RNA、MCF-7 DEDD-sh RNA稳定细胞株由本实验室前期通过转染带有相应sh RNA片段的质粒经潮霉素筛选构建完成[20]。细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,其中MCF-7 control sh RNA、MCF-7 DEDD-sh RNA细胞另加入维持浓度潮霉素350μg/m L,置于含有5%CO2饱和湿度的37℃培养箱中培养。2采用MTS法检测多柔比星、紫杉醇对MCF-7 WT、MCF-7 control sh RNA、MCF-7 DEDD-sh RNA细胞活力的影响。3流式细胞术检测多柔比星、紫杉醇对MCF-7 WT、MCF-7 control sh RNA、MCF-7 DEDD-sh RNA细胞作用24h时细胞凋亡情况。4 RT-PCR法检测干扰DEDD表达后抗肿瘤药物(多柔比星、紫杉醇)作用24h、48h后MCF-7 WT、MCF-7 control sh RNA、MCF-7 DEDD-sh RNA细胞中ABCB1基因、ABCG2基因的表达情况。5 Western blot蛋白印记法检测干扰DEDD表达后0.5μM多柔比星、8μg/ml紫杉醇对MCF-7 WT、MCF-7 control sh RNA、MCF-7 DEDD-sh RNA细胞P-gp蛋白、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)的表达变化。6 Western blot蛋白印记法检测MCF-7 control sh RNA、MCF-7DEDD-sh RNA细胞中Bcl-2、Bcl-xl、Bak、Bax蛋白的表达。7 RT-PCR检测MCF-7 control sh RNA、MCF-7 DEDD-sh RNA细胞中Bcl-2基因的表达。8 Western blot蛋白印记检测加入Cycloheximide(CHX)干预后MCF-7control sh RNA、MCF-7 DEDD-sh RNA细胞中Bcl-2蛋白降解情况。9 MTS法检测Bcl-2抑制剂ABT-199对人乳腺癌MCF-7 control sh RNA、MCF-7 DEDD-sh RNA细胞活力的影响。10 MTS法检测ABT-199联合多柔比星对人乳腺癌MCF-7 control sh RNA、MCF-7 DEDD-sh RNA细胞活力的影响。结果:1多柔比星药物干预24h、48h后,MCF-7 DEDD-sh RNA细胞在浓度为0.1μM、1μM、10μM时组细胞存活率要显著高于MCF-7 WT组与MCF-7 control sh RNA组(P<0.01)。多柔比星干预MCF-7 DEDD-sh RNA细胞24h和48h的半数抑制浓度IC 50分别为0.974μM,0.621μM,明显高于WT(0.456μM,0.261μM)和control sh RNA细胞(0.391μM,0.247μM)。2紫杉醇干预培养24h与48h后,与MCF-7 WT组相比,紫杉醇药物浓度在1μg/ml、4μg/ml、8μg/ml时MCF-7 DEDD-sh RNA组细胞存活率要显著高于MCF-7 WT组(P<0.01)。与MCF-7 control sh RNA组相比,紫杉醇药物浓度在4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml时MCF-7 DEDD-sh RNA组细胞存活率要显著高于MCF-7 control sh RNA组(P<0.01)。紫杉醇干预MCF-7 DEDD-sh RNA细胞24h和48h的半数抑制浓度IC 50分别为14.293μg/ml,8.416μg/ml,明显高于WT(11.432μg/ml,6.568μg/ml)和control sh RNA细胞(10.756μg/ml,6.926μg/ml)。3浓度为0.5μM、1μM的多柔比星干预MCF-7WT、MCF-7 control sh RNA、MCF-7 DEDD-sh RNA细胞24h后,MCF-7 DEDD-sh RNA组细胞与MCF-7 WT组、MCF-7 control sh RNA组细胞相比凋亡率明显增加(P<0.01);浓度为8μg/ml与16μg/ml的紫杉醇干预MCF-7WT、MCF-7control sh RNA、MCF-7 DEDD-sh RNA细胞24h后,MCF-7 DEDD-sh RNA组细胞与MCF-7 WT组、MCF-7 control sh RNA组细胞相比凋亡率明显增加(P<0.01)。4在给予多柔比星、紫杉醇药物刺激后,ABCB1、ABCG2基因的表达均出现上调。与MCF-7 WT组相比,0.5μM的多柔比星干预24h、48h后MCF-7 DEDD-sh RNA组ABCB1与ABCG2基因的表达显著升高(P<0.01);与MCF-7 control sh RNA组相比,MCF-7 DEDD-sh RNA组在24h与48h时ABCB1与ABCG2基因要高于MCF-7 control sh RNA组,但在0h时MCF-7 control sh RNA组高于MCF-7 DEDD-sh RNA组;8μg/ml紫杉醇药物干预24h、48h后,MCF-7 DEDD-sh RNA组ABCB1基因、ABCG2基因表达均高于MCF-7 WT组与MCF-7 control sh RNA组。MCF-7WT、MCF-7 control sh RNA、MCF-7 DEDD-sh RNA三种细胞内ABCG2基因的表达均显著高于ABCB1基因。5 0.5μM多柔比星或8μg/ml紫杉醇药物干预0h、24h、48h后,MCF-7WT、MCF-7 control sh RNA、MCF-7 DEDD-sh RNA细胞中均未检测到P-gp蛋白的表达。6 0.5μM多柔比星或8μg/ml紫杉醇药物干预0h、24h、48h后,BCRP蛋白在MCF-7WT、MCF-7 control sh RNA、MCF-7 DEDD-sh RNA中均有表达,0h、24h时MCF-7WT、MCF-7 control sh RNA、MCF-7 DEDD-sh RNA三种细胞BCRP蛋白的表达无显著性差异,而在48h后MCF-7DEDD-sh RNA细胞BCRP蛋白的表达要显著高于MCF-7 WT、MCF-7control sh RNA细胞(P<0.01)。7 MCF-7 control sh RNA和MCF-7 DEDD-sh RNA细胞中Bcl-xl、Bak、Bax蛋白的表达均无差异,而Bcl-2蛋白的表达在干扰DEDD表达的MCF-7细胞中显著降低(P<0.01)。8 PCR检测发现,与MCF-7 control sh RNA细胞相比,在干扰DEDD表达后的MCF-7 DEDD-sh RNA细胞中Bcl-2基因的表达明显降低(P<0.01)。9加入CHX抑制蛋白合成后,MCF-7 control sh RNA、MCF-7DEDD-sh RNA细胞中Bcl-2蛋白随时间的增加而降解增加,在3h时MCF-7DEDD-sh RNA细胞蛋白降解速率明显高于MCF-7 control sh RNA组(P<0.01),其他时间点无显著性差异。10 Bcl-2抑制剂ABT-199干预MCF-7 control sh RNA、MCF-7DEDD-sh RNA细胞24h、48h后,细胞存活率降低,而在药物浓度为20μM时,MCF-7 DEDD-sh RNA细胞的存活率显著低于MCF-7 control sh RNA细胞(P<0.01)。两组细胞ABT-199干预24h、48h后的半数抑制浓度分别是:MCF-7 control sh RNA(29.003μM,27.328μM)、MCF-7 DEDDsh RNA(25.436μM,25.280μM)。11 10μM ABT-199联合0.5μM多柔比星干预MCF-7 control sh RNA、MCF-7 DEDD-sh RNA细胞24h后两种细胞存活率较单纯给予0.5μM多柔比星无明显差异,而在48h后两种细胞存活率较单纯给予0.5μM多柔比星明显降低。联合用药干预24h、48h后两种细胞存活率与单纯给予0.5μM多柔比星药物干预比值分别为MCF-7 control sh RNA(1.018,0.577),MCF-7 DEDD-sh RNA(1.003,0.705)。10μM ABT-199联合1μM多柔比星干预MCF-7 control sh RNA、MCF-7 DEDD-sh RNA细胞24h、48h后两种细胞存活率较单纯给予1μM多柔比星均明显降低。联合用药干预24h、48h后两种细胞存活率与单纯给予1μM多柔比星药物干预比值分别为MCF-7 control sh RNA(0.723,0.503),MCF-7 DEDD-sh RNA(0.703,0.539),统计学分析联合用药对两种细胞作用差异不明显(P>0.05)。结论:1 DEDD作为一个促凋亡基因,干扰DEDD表达可增强人乳腺癌MCF-7细胞的抗肿瘤药耐药性,抑制细胞凋亡。2在给予药物干预后,稳定干扰DEDD可促进MCF-7细胞中相关耐药基因ABCB1、ABCG2的m RNA表达和乳腺癌耐药蛋白BCRP的表达。3 DEDD敲低后抑制了抑凋亡蛋白Bcl-2的基因和蛋白表达,MCF-7DEDD-sh RNA细胞对于Bcl-2抑制剂ABT-199更为敏感,抑制Bcl-2信号通路可增强MCF-7细胞对化疗药物的敏感性,提示对于DEDD低表达的乳腺癌患者可考虑应用Bcl-2抑制剂进行治疗。