RNA干扰技术是生命科学研究中的一项不可替代的强有力的研究手段，在哺乳动物细胞中沉默目标基因用以研究基因和蛋白质的功能，而且在人类疾病病理学的研究中具有重要的地位。随着人类基因组计划的完成，生命科学的研究进入到后基因组学的阶段。在这个阶段，研究者们急切的需要一些能够适用于高通量和基因组规模的RNA干扰义库的构建手段来研究基因和蛋白质的功能及相互作用，而传统的RNA干扰表达载体的构建方法成本高、效率低、步骤繁杂、突变率高的缺点是不适合高通量快速高效低成本的需求的。　　 本研究中，我们提出了两种新颖的快速高效的构建哺乳动物细胞RNA干扰载体的方法，目的在于解决传统RNA干扰载体构建中突变率高、成本高、效率低及步骤繁杂的问题，从而发展出适用于高通量需求的快速高效低成本的RNA干扰载体的构建方法。第一种方法使用了GFP和ccdB基因作为筛选标记，合成短小的引物，采用一步PCR反扩的构建策略，形成线性的表达载体，通过大肠杆菌体内同源重组，从而形成具有功能的RNA干扰表达载体，而且重组了的筛选方法极其简便。通过这种方法，我们构建了五百多个表达载体，测序的准确率在85％以上。第二种方法利用了lacO的特点和蓝白斑筛选的原理，需要合成的引物更短。通过引物延伸的策略构建出shRNA表达片段，然后亚克隆到骨架载体中形成具有功能的表达载体。同样，这种方法对于重组子的筛选也是直观简便的。通过这种方法，我们构建了大约120个表达载体，阳性克隆测序的准确率达到80％。　　 我们希望这些简便、高效、低成本的方法能够适用于高通量和基因组规模的RNA干扰文库的构建，为生命科学的研究贡献一份力量。