研究背景随着近年来饮食结构的改变、老龄化社会的到来、社会竞争的激烈化以及代谢性疾病(如高脂血症、糖尿病)发病率的升高,冠状动脉粥样硬化性心脏病、缺血性脑血管疾病、外周缺血性疾病等缺血相关疾病的发病率随之攀升。下肢缺血性疾病因跛行、静息痛等缺血症状难以缓解,坏疽引起致残率高等原因严重影响生活质量而引起重视。虽然外周缺血性疾病的常规药物治疗、外科和经皮介入血管重建术已有很大发展,但预后仍然不尽人意。迄今为止,仍无药物能显著、有效改善其预后。血管重建术后较高的再狭窄率在一定程度上影响了该项技术的应用。同时有些患者由于血管病变严重、狭窄分布弥漫等原因已不适合进行血管重建。尤其对于重症患者,当出现与缺血相关的严重静息痛和严重溃疡时,多被迫选择截肢。针对缺血性疾病有效治疗措施的研究已成为当务之急,治疗性血管生成理论的提出,给缺血性疾病患者带来了新的希望。在血管狭窄或阻塞等原因引起组织器官缺血时,机体内促血管生成相关因子的表达反应性增加,通过促进缺血局部的血管生成从而改善血流灌注,但自身的作用往往不能达到充分代偿。外源性补充促血管生成因子(重组蛋白或基因)在理论上可增强血管生成从而进一步改善缺血组织的血液供应,称为治疗性血管生成。近年来有关缺血性疾病治疗性血管新生的研究主要包括蛋白质治疗和基因治疗,但由于蛋白质治疗所需剂量大、维持时间短暂、常需反复应用,目前已很少采用。相对而言,基因治疗可在局部持续表达起作用,有可能仅需单次治疗,从而使治疗过程趋于简单化。故而以基因转染技术来促进缺血器官、组织血管生成成为目前该领域的研究热点。血管生成是个复杂的生物学过程,需要多种因子参与及协调作用。最早应用于血管新生研究的VEGF和FGF曾引起普遍关注,它们在引起缺血组织血管生成的临床前研究及Ⅰ期临床研究中,均取得了较满意的结果。但在促血管新生的Ⅱ期临床试验中发现VEGF可引起不成熟血管的形成、出现血管渗漏、组织水肿等不良反应；FGF在促进新生血管形成的同时,部分患者出现蛋白尿。这些原因使VEGF和FGF在治疗性血管生成领域的研究受到了一定限制。故而,有必要寻找其它更适合于临床应用的促血管生成因子。低氧诱导因子-1(HIF-1)作为促血管生成的上游基因引起了研究者的重视。近年来研究显示：HIF-1是个重要的核转录因子,能直接或间接调控多种下游靶基因,包括：血管生长、血管张力、糖代谢、红细胞生成等。到目前为止,已发现参与血管新生的30多种基因(如：VEGF、PLGF、SDF)受HIF-1的调控。HIF-1由α亚单位和β亚单位组成,以异源性二聚体的形式存在。HIF-1β是其结构型表达,与保持HIF-1结构的稳定性及二聚化引起活性构象改变有关,不受氧浓度的调节；HIF-1α是受O2浓度调节的HIF-1亚单位,决定HIF-1的活性。在低氧情况下,HIF-1α的表达增强,对下游基因的调控作用亦增强。HIF-1α有两个重要结构区,氧依赖降解区(ODDD)和转录激活区(TAD),其中TAD包括N-TAD和C-TAD。目前已知,C-TAD对大部分转录活性的控制通过与辅助激活因子的作用。常氧环境下,脯氨酰羟化酶作用于ODDD区的402位和564位两个脯氨酸(Pro)残基,发生羟基化作用,导致HIF-1α在数分钟内迅速发生降解。而对HIF-1α的CAD区803位天门冬酰氨(Asn)的羟基化作用,可阻止HIF-1α与部分辅助激活因子的结合,降低其转录活性。低氧环境下,脯氨酸羟化酶和天门冬酰氨酶失活,稳定状态的HIF-1α和HIF-1β结合,通过C-TAD和辅助激活因子(如CBP/p300)的结合,从而增强下游促血管生成因子的表达。故而,在理论上将ODDD区的402,564位点及TAD区的803位点三个位点联合突变将获得具有良好稳定性和转录活性的HIF-1a,从而增强对下游诸多促血管新生因子的调控。本课题组已先期将HIF-1a的上述三位点联合定点突变,成功构建了腺病毒介导的三突变型HIF-1a564/402/803(Ad-HIF-1a-Trip),从而使其在常氧环境下能高效、稳定表达。已有研究表明,Ad-HIF-1a的三突变体在离体实验中稳定性增强,并能促进下游促血管生成因子的表达。目的本研究建立兔急性后肢缺血模型,采用肌肉注射的方式,将Ad-HIF-1a-Trip转染于兔缺血后肢局部,研究Ad-HIF-1a-Trip对下游基因(VEGF)表达的影响及对缺血后肢的促血管生成作用；研究Ad-HIF-1a-Trip的在体表达情况及对新生血管渗透性的影响。方法1.将本课题组先期构建的重组腺病毒空载(Ad-Null)、重组腺病毒HIF-la三突变体(Ad-HIF-1a-Trip)在低代HEK293A细胞中进行病毒扩增；氯化铯浓度梯度离心透析纯化；终点稀释法及分光光度计法测定病毒滴度；病毒纯化后提取DNA进行PCR检测,对Ad-HIF-1a-Trip同时行基因测序进行鉴定。2.建立急性兔后肢缺血模型,随机分成3组：生理盐水组、Ad-Null组、Ad-HIF-1a-Trip组。兔缺血后肢局部通过肌肉注射方式进行病毒转染或给予生理盐水。基因转染后7天行Real-time PCR和Western blot免疫印迹检测HIF-1a及其下游基因VEGF的表达；基因转染后0天、7天,14天,28天,对兔后肢进行对比超声(CEU)及血管超声检查,了解缺血后肢血流灌注情况,基因转染后第28天,兔缺血后肢肌肉CD31免疫组化检查,计数微血管密度(MVD)；兔后肢行CTA及动脉铸型观察血管生长情况。3.建立急性兔后肢缺血模型,随机分成3组：生理盐水组、Ad-Null组、Ad-HIF-1a-Trip组。兔缺血后肢局部通过肌肉注射方式进行病毒转染或给予生理盐水。基因转染后10天行Real-time PCR检测所转染外源基因在靶器官(缺血侧基因转染部位肌肉组织)和靶外器官(健侧骨骼肌、心、肝、肺、肾、睾丸)的表达；基因转染后28天伊文思兰法检测缺血后肢新生血管的渗漏情况。4.应用SPSS13.0统计软件进行数据分析,计量数据以x±s表示。多个时间点CEU所测得(A×p)标化值与超声心动图所测得髂内动脉血流量标化值(Q1/2)采用重复测量的方差分析,同一时间点的组间对比及组内不同时间点的对比采用单向方差分析,方差齐时组间多重比较采用LSD法,方差不齐时采用Games-Howell检验；免疫组化MVD计数、CTA血管计数、血管铸型面积标化值、Real-time PCR所得HIF-1αmRNA相对表达量、伊文思蓝含量三组间比较采用单向方差分析。缺血程度比较采用多级等级资料非参数检验(Kruskal-Wallis Test)。P<0.05差异有统计学意义。结果1.在HEK293A细胞内反复扩增后获得重组腺病毒Ad-Null和Ad-HIF-1α-Trip,氯化铯纯化后O.D.260nm测得Ad-Null、Ad-HIF-1α-Trip滴度分别为2.6×1013VP/ml、3.9×1013VP/ml, OD260/OD280分别为：1.32、1.38；终点稀释法测得的滴度分别为2.2x1012PFU/ml、3.7×1012PFU/ml。提取所扩增病毒DNA后进行PCR和基因测序,目的信息完整,无变异或丢失。所扩增病毒能满足动物实验要求。2.兔急性后肢缺血模型基因转染后7天,Real-time PCR结果显示：Ad-HIF-1α-Trip组HIF-1α的mRNA水平表达明显高于生理盐水组和Ad-Null组(P<0.01)。Western blot结果显示,Ad-HIF-1α-Trip组HIF-1α和VEGF蛋白显影明显强于生理盐水组和Ad-Null组(P<0.01)。3.CEU结果显示：各组缺血患肢血流灌注均呈现随时间而增长的趋势,但Ad-HIF-1α-Trip组血流灌注恢复程度明显快于其它各组,在基因转染后7天、14天、28天,三组间均存在显著差异(均为P<0.01)。血管超声结果显示,可在一定程度上间接反映缺血患肢血流灌注的患侧髂内动脉血流量以Ad-HIF-1α-Trip组增加最为明显,在基因转染后7天、14天、28天与生理盐水组和Ad-Null组间均存在显著差异(均为P<0.01)。4.兔急性后肢缺血模型基因转染后28天,病理切片免疫组化CD31染色结果显示：Ad-HIF-1a-Trip组微血管密度(MVD)计数明显多于生理盐水组和Ad-Null组(P<0.01); CTA结果显示：Ad-HIF-1a-Trip组血管造影评分高于Ad-Null组和生理盐水组(P<0.01)。兔急性后肢缺血模型基因转染后28天,动脉血管铸型结果显示Ad-HIF-1a-Trip组血管密度明显多于Ad-Null组和生理盐水组(P<0.01)。5.Ad-Null组和生理盐水组上述各项检查指标组间对比无显著差异。6.基因转染后10天,Real-time PCR结果显示：缺血患肢可检测到外源HIF-1a在mRNA水平的表达,靶外器官(心、肝、肾、肺、睾丸、健侧肌肉)无外源HIF-1a表达；病理切片HE染色靶外器官未见明显异常肿瘤状物和异常血管网的形成,未见显著形态学改变。伊文思蓝结果示：基因转染后28天Ad-HIF-la-Trip组缺血患肢伊文思蓝含量略高于其它生理盐水组和Ad-Null组,但三组间差异无统计学意义,表明三者间新生血管渗透性无显著差异。结论1.Ad-HIF-1a-Trip经肌肉注射局部转染后在兔缺血后肢能良好表达；Ad-HIF-1a-Trip可促进兔缺血后肢血管生成,增强缺血组织血流灌注；新生血管渗透性无异常增加;2.通过肌肉注射的方式进行转染,Ad-HIF-1a-Trip在靶外器官(健侧后肢肌肉、心、肝、肾、肺、睾丸)无表达,未引起明显肿瘤状物及异常血管网形成。3.局部肌肉注射转染Ad-HIF-1a-Trip是治疗外周缺血性疾病有效可行的方法,同时为治疗其它缺血性疾病提供了新的思路。