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丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus,HCV）感染是引起慢性肝病的主要病因,严重危害人类健康。目前全世界大约2亿左右人感染丙型肝炎病毒,中国HCV流行非常严重,大约有4000万人感染HCV病毒。该病毒可造成急、慢性病毒性肝炎,超过70%的感染者会发展为慢性感染,30%的感染者会通过自身的免疫系统清除体内的病毒,其中慢性感染者中只有5%的病人最终会死于肝硬化（Hepatocellular cirrhosis,HC）和肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）。目前国际上标准丙型肝炎治疗方案为聚乙二醇干扰素（PEG-IFN-α）-利巴韦林（Ribavirin,RBV）联合疗法,该疗法仍存在因病毒基因型差异疗效不一、费用昂贵、停药后病疾病复发等问题。同时,疫苗的研究也尚未取得有效进展,丙型肝炎的防治情况异常严峻。对疾病防控的最好方法是及早准确诊断,以控制传播源头,切断传播途径。HCV主要的检测技术为核酸检测、抗体检测、抗原检测,核酸抗体检测联合检测。HCV核酸检测准确率高,对实验设备要求高,对操作人员要求高,容易污染且价格昂贵,常规医院还没有广泛应用。抗体检测操作方便,可重复性好,但存在窗口期漏检,也不能对多种基因型感染的病毒都有效检出。HCV的NS3蛋白抗原免疫性强,存在多个抗原决定簇,容易检测,建立以NS3蛋白为检测靶点的抗原检测方法,可降低检测技术依赖程度、避免窗口期漏检,提高检测效率。本实验目的是表达重组HCV NS3蛋白,纯化NS3蛋白,免疫动物制备高效的抗体,从而建立高灵敏度HCVNS3抗原诊断试剂盒。通过生物信息学相关软件我们对HCV NS3蛋白序列进行分析,预测HCV NS3蛋白分子量为67kDa左右,NS3蛋白存在多个亲水结构域,NS3蛋白不存在典型的跨膜区,NS3蛋白存在多个优势抗原表位。设计可覆盖NS3蛋白多个优势抗原表位编码基因片段的PCR引物,可有效扩增主要流行基因型对应NS3基因片段。用该引物对J6/JFH1 2a病毒全长HCV基因组中NS3基因片段进行PCR扩增,将NS3基因片段（1893bp）连接到PET28a载体中,成功构建了PET28a-NS3重组表达载体。将重组表达载体PET28a-NS3转化到BL21大肠杆菌表达菌中,重组菌在摇床转速为250r/min,IPTG浓度为1mmol/L,诱导温度为37℃,诱导5h后,NS3蛋白得到了大量的表达。重组蛋白主要以包涵体的形式存在,通过超声破碎菌体,8M尿素溶解过夜后,通过Ni2+-NTA亲和层析柱能纯化出目的的NS3蛋白。使用纯化的NS3蛋白包被酶标板,通过间接ELISA方法检测病人血浆,结果显示纯化的NS3蛋白能够与PCR确定为阳性的病人血清有很好的反应效果,说明所纯化的NS3蛋白具有良好的抗原性。将纯化的NS3蛋白免疫新西兰大白兔,使用间接ELISA法检测兔多抗的效价,结果显示兔多抗血清效价能达到1:512000。使用Western blot方法鉴定兔多抗,结果显示所制备的兔多抗具有很好的特异性。用纯化的NS3蛋白免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA法检测第四次免疫血清效价能达到1:256000。通过Western blot鉴定小鼠的多克隆抗体,结果显示出很好的特异性。通过间接免疫荧光方法,以HCV（J6/JFH1）病毒感染三天的肝癌细胞铺板,以制备的小鼠多抗体为一抗,结果显示有很好的荧光免疫反应效果。本论文成功表达HCVNS3全长蛋白,纯化出很好的单一蛋白,纯化的蛋白免疫性很强,制备出高效价的多克隆抗体,这为HCV抗原检测方法的多样性提供理论基础,为开发出高灵敏度的HCV抗原检测试剂盒做好了铺垫。所纯化出的NS3蛋白特异性很好,能与HCV病人阳性血清很好的反应,为HCV NS3蛋白功能的研究和HCVNS3单克隆抗体的制备奠定了基础。