目的：　　人巨细胞病毒(Human Cytomegalovirus，HCMV)感染在人群中普遍存在，可引起新生儿多种畸形和疾病，也可引起免疫低下患者的致死性感染，其危害巨大。有学者推测HCMVUL/b区可能在病毒的复制、潜伏和对宿主的致病性方面起重要作用，因而UL/b区基因及编码蛋白在HCMV感染和致病性方面受到特殊关注。位于HCMVUL/b区内的UL141基因，其编码产物是糖蛋白双联体，分子量在37-40kDa之间。目前已知其编码蛋白能够抑制细胞表面CD155，CD122，TRAIL-R1以及TRAIL-R2的表达，从而逃避NK细胞介导的细胞杀伤作用。本文从酵母双杂交筛选、Pull-down、激光共聚焦技术、免疫共沉淀等技术筛选并鉴定HCMVUL141编码蛋白与胎脑文库组织相互作用的蛋白以及相互作用蛋白对HCMV复制的影响。以上研究将有利于阐明病毒基因在致病和复制中的功能，进而深入理解HCMV的感染机制。　　实验材料与方法：　　一、实验材料　　标本来自中国医科大学附属盛京医院病毒室保存的临床低传代HCMV分离株H株（传代次数＜5次）。MatchmakerGALTwo-HybridSystem购自Clontech公司(Japan)。人胎脑cDNA文库由武汉大学生命科学院肖庚富教授惠赠。MagneGSTTMPull-downSystem试剂盒购于Promega公司(USA)。ProFoundc-MycTagIp/Co-IpKit，ProFoundHATagIp/Co-IpKit试剂盒购于ThermoScientific公司(USA)。Lipofectamine2000,LipofectamineRNAiMAXReagent购于Invitrogen公司。细胞基因组DNA提取试剂盒购于TIANGEN公司。PowerSYBRGreenPCRMasterMin购于LifeTechnologies公司(USA)。引物合成及测序由Invitrogen公司(Shanghai，China)完成。常用数据库及分析软件如基因组数据库、蛋白质分析数据库、引物设计软件等。　　二、实验方法　　（一）酵母双杂交筛选　　1、以HCMVH株的DNA为模板，利用PCR扩增获得UL141基因片段，将Sfi-Ⅰ和Sal-Ⅰ酶切后的UL141基因片段连接至同时酶切的pGBKT7载体上，构建pGBKT7-UL141重组质粒，PCR鉴定，并测序分析验证。　　2、将pGBKT7-UL141重组质粒与人胎脑eDNA文库质粒共同转化至酵母菌株AH109中，涂布于二缺（SD/-Leu/-Trp）及四缺（SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade）培养基平板上，30℃培养至菌落长出，以X-gal筛选蓝色的阳性克隆。　　3、提取阳性克隆的酵母质粒，电穿孔转化到大肠杆菌TG1中，在含氨苄青霉素的培养基中筛选出含cDNA文库的阳性克隆。进行回转验证，观察其在四缺培养基上的生长状况。　　4、鉴定后的阳性克隆进行测序，经Genbank生物信息学软件进行BLAST分析。　　（二）Pull-down技术鉴定　　1、利用EcoRⅠ和XhoⅠ两种限制性内切酶，酶切文库质粒pACT2-CELF5，克隆到同时双酶切的含有GST标签的pGEX-4T-2载体上，构建重组质粒pGEX-CELF5。　　2、利用TNT体外转录翻译系统，将pGBKT7-UL141重组质粒作为捕获蛋白进行体外转录;提取在大肠杆菌中表达的pGEX-CELF5蛋白，作为诱饵蛋白将其固相化到MagneGSTTMparticles上，按照MagneGSTTMPull-downSystem操作进行，将两种蛋白共同孵育，洗脱，纯化，Westernblot技术分析相互作用的蛋白复合物，电化学发光法鉴定结果并分析。　　（三）激光共聚焦技术的细胞定位分析　　1、将含有EcoRⅠ和BamHⅠ粘性末端的UL141基因片段，克隆到同时双酶切的含有绿色免疫荧光标记的pEGFP-C1载体上，构建重组质粒pEGFP-UL141;采用同样的方法将筛选得到的文库质粒克隆到含有红色免疫荧光标记的pDsRed-C1载体上，构建重组质粒pDsRed-CELF5，并测序分析验证。　　2、培养人胚肾293T细胞。采用脂质体转染的方法，将pEGFP-UL141和pDsRed-CELF5共转染入293T细胞中，利用激光扫描共聚焦显微镜观察两种蛋白表达及定位情况。　　（四）Co-Immunoprecipitation技术鉴定　　1、利用Sfi-Ⅰ和Not-Ⅰ两种限制性内切酶，酶切质粒pGBKT7-UL141，克隆到同时双酶切的pCMV-Myc载体上，构建重组质粒pCMV-Myc-UL141;利用EcoRⅠ和XhoⅠ两种限制性内切酶，采用同样的方法将筛选得到的文库质粒克隆到pCMV-HA载体上，构建重组质粒pCMV-HA-CELF5，并测序分析验证。　　2、培养人胚肾293T细胞，采用脂质体转染的方法，将pCMV-UL141和pCMV-CELF5共转染入293T细胞中，转染24小时后裂解细胞并提取上清，按照ProFoundc-MycTagIp/Co-IpKit及ProFoundHATagIp/Co-IpKit操作说明，将上清分别与含有c-Myc及HA抗体的琼脂糖孵育，洗脱，最后采用Westernblot技术分析相互作用的蛋白复合物，电化学发光法分析、鉴定结果。　　（五）实时定量PCR技术分析蛋白功能　　1、培养人脑神经胶质瘤U373MG细胞，采用脂质体转染的方法，将pCMV-CELF5、SiRNA-CELF5、C-SiRNA分别转染入U373MG细胞中，提取相应细胞蛋白，Westernblot技术分析过表达及干扰CELF5的结果。　　2、上述细胞在转染后感染HCMV，感染48小时后收集细胞提取相应细胞DNA，采用实时定量PCR的方法分别检测相应细胞中HCMVDNA的相对量。　　结果：　　一、酵母双杂交　　1、用特异性引物成功扩增出HCMVUL141基因片段，片段长度为1017bp并成功将其克隆到酵母系统的转录结合域pGBKT7载体上，命名为pGBKT7-UL141，测序分析显示结果与预期一致。测序结果表明融合区域的读码框正确，经测序证实为HCMVUL141序列且无碱基突变。　　2、将pGBKT7-UL141重组质粒与人胎脑cDNA文库质粒共同转化入酵母细胞AH109中，经过重复筛选从SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板筛选出24个阳性克隆。　　3、对验证后阳性克隆质粒测序和生物信息学分析共获得以下6个候选基因:CHD3，编码人染色质解旋酶DNA结合蛋白3;DNAJB1，编码热休克蛋白40亚族B1;DACH1，编码人细胞命运决定因子;TLE1，编码转导蛋白样增强子1;WTIP，编码肾母细胞瘤相互作用蛋白1;CELF5，编码人胚胎致死异常视觉家族蛋白5，其中筛选的阳性克隆与CELF5高度同源，同源性100％。　　二、Pull-down技术鉴定　　1、将文库质粒pACT2-CELF5用EcoR1和Xho1酶切后克隆到含有GST标签的pGEX-4T-2载体上，PCR鉴定，测序分析，克隆成功。　　2、将重组质粒pGEX-CELF5转化入大肠杆菌BL21中，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，CELF5融合蛋白成功表达。　　3、按照MagneGSTTMPull-downSystem操作，通过Westernblot的方法检测，结果发现两种蛋白在体外发生直接的相互作用。　　三、激光共聚焦显微镜技术鉴定　　1、采用EcoR1和BamH1限制性内切酶，构建重组质粒pEGFP-UL141和pDsRed-CELF5，PCR鉴定，测序分析显示克隆成功。　　2、采用脂质体转染的方法，将上述两种重组质粒共同转染至生长状态良好的具有75％融合度的人胚肾293T细胞中，48小时后，通过共聚焦显微镜，利用488-nm波长和543-nm波长激光束观察蛋白分布，观察到HCMVUL141编码蛋白与CELF5编码蛋白共定位于细胞质。　　四、免疫共沉淀技术进一步鉴定　　1、分别采用Sfi-Ⅰ、Not-Ⅰ以及EcoR-Ⅰ、Xho-Ⅰ两对限制性内切酶，构建重组质粒pCMV-Myc-UL141和pCMV-HA-CELF5，PCR鉴定，测序分析显示克隆成功。　　2、采用脂质体转染的方法，将上述两种重组质粒共同转染至生长状态良好的具有90％融合度的人胚肾293T细胞中，24小时后收集并裂解细胞，提取细胞蛋白，将上清分别与含有c-Myc及HA抗体的琼脂糖孵育，经洗脱，最后通过c-Myc及HA抗体进行Westernblot检测，结果发现两种蛋白在体内发生相互作用。　　五、实时定量PCR技术分析蛋白功能　　1、培养人脑神经胶质瘤U373MG细胞，采用脂质体转染的方法，将pCMV-HA-CELF5、SiRNA-CELF5、C-SiRNA分别转染入U373MG细胞中，提取相应细胞蛋白，通过CELF5抗体进行Westernblot检测，结果显示在U373MG细胞中成功过表达及干扰CELF5。　　2、上述细胞在转染24h后感染HCMV，感染48小时后收集细胞提取相应细胞DNA，采用实时定量PCR的方法分别检测相应细胞中HCMVDNA的相对量，结果提示过表达CELF5能够促进HCMV的复制，干扰CELF5的表达对HCMV的复制没有明显影响。　　结论：　　应用酵母双杂交初步筛选出HCMVUL141蛋白和人胎脑文库蛋白CELF5发生相互作用，通过Pull-down、免疫共沉淀以及激光共聚焦实验进一步证实这两种蛋白间的相互作用并共同定位于细胞质，通过荧光定量PCR实验证实CELF5的过表达促进HCMV的复制，因此在HCMV感染过程中，UL141编码蛋白可能通过与CELF5的相互作用，促进HCMV的复制。