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L-天冬酰胺酶（E.C.3.5.1.1）催化L-天冬酰胺水解生成L-天冬氨酸和氨,在医药和食品行业中都具有重要应用。在医药行业中,L-天冬酰胺酶能降解肿瘤细胞代谢所必须的L-天冬酰胺,抑制肿瘤细胞生长,进而被用到治疗淋巴瘤细胞白血病当中;在食品行业中,L-天冬酰胺酶能降解食品中潜在致癌物质丙烯酰胺的前体L-天冬酰胺,从而减少丙烯酰胺的含量。然而无论是在医药还是在食品行业中,L-天冬酰胺酶依然存在热稳定性差、催化效率低等问题,同时较低的产量,也限制了L-天冬酰胺酶的应用。因此,鉴定和构建出热稳定性更好、比酶活更高的L-天冬酰胺酶,并实现高产表达具有重要的研究意义。本研究表征了嗜热菌Pyrococcus yayanosii CH1来源L-天冬酰胺酶的酶学特性,并解析了影响其热稳定性的关键功能结构域,通过高通量筛选得到酶活更高和热稳定性更好的嗜热L-天冬酰胺酶突变株,并通过表达元件筛选、发酵工艺优化实现L-天冬酰胺酶的高产发酵。主要研究结果如下:（1）以食品安全菌株枯草芽孢杆菌168为宿主菌,分别表达了非嗜热菌（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌B11-06）来源L-天冬酰胺酶和嗜热菌（P.yayanosii CH1、Thermococcus gammatolerans EJ3、P.furiosus DSM 3638）来源L-天冬酰胺酶。在摇瓶发酵水平,P.yayanosii CH1 L-天冬酰胺酶（PYA）表达量最高,达到89.03U?mL-1,展现出较好的发酵潜力。解析P.yayanosii CH1 L-天冬酰胺酶的酶学性质,最适温度和pH分别为95°C和8.0,并具有较高比酶活(1483.81 U?mg-1)。同时该酶展现出良好的热稳定性和碱性条件下的稳定性,在85°C下半衰期(T（1/2,85°C）)达到105分钟,并且37°C储藏1个月残余酶活仍能保留90%以上;在pH=10环境中储藏30小时,残余酶活仍能保留80%以上。（2）利用生物信息学分析了千余种嗜热与非嗜热L-天冬酰胺酶亲缘关系和残基保守性,发现嗜热与非嗜热L-天冬酰胺酶高度保守区域附近存在特异性氨基酸残基,这些残基在嗜热和非嗜热L-天冬酰胺酶中分别高度保守,但二者之间却不相同,推测可能由于这些氨基酸残基位点及其所在功能结构域的改变,造成L-天冬酰胺酶分化为嗜热和非嗜热L-天冬酰胺酶。为了验证这些位点及功能结构域,对这两类L-天冬酰胺酶的特异性位点及功能结构域进行了替换改造。利用蛋白质结构模型比对、分子动力学模拟等手段解析了造成热稳定性差异的关键残基（PYA残基D51和K298,对应E.coli L-天冬酰胺酶的残基G57和L305）,并发现L-天冬酰胺酶的活性中心附近Loop环柔韧性、表面电荷的高低、C端α-螺旋与C端尾部连接的紧密程度直接影响着L-天冬酰胺酶的热稳定性。基于此结论,我们对大肠杆菌来源医药用L-天冬酰胺酶的功能结构域上的关键残基进行了突变,成功将该酶在37°C下的热稳定性及比酶活分别提高了1.61倍和2.74倍。（3）将热裂解细胞和酶活测定进行同步,建立起适用于筛选高热稳定性、高酶活嗜热L-天冬酰胺酶的高通量筛选方法。对PYA基因进行两轮易错PCR（epPCR）构建突变文库,通过高通量筛选从6000个突变株中筛选出880个正向突变株,发现含有残基突变S17G、A90S、R156S、K272A的突变株分别占有效正突变株的31%,28%,39%,25%,远超过其他残基突变的概率,推测可能由于这些位点的突变导致酶活或热稳定性的提高。分别构建这些单点突变株,突变株PYA-S17G、PYA-R156S、PYA-K272A的比酶活分别提高到原始酶PYA的1.72、1.62、1.27倍,突变株PYA-A90S在85°C的半衰期(T（1/2,85°C）)延长了45分钟。这4个残基的复合突变株PYA-FH的比酶活提高到原始酶的2.1倍,且其T（1/2,85°C）从105分钟延长到145分钟。（4）通过筛选启动子将PYA基因在枯草芽孢杆菌168中的转录水平提高到原来的8.2倍,但酶活产量仅提高到原来的1.32倍,转录水平的提高和产量提高程度的不匹配可能是由于翻译水平低于原始菌所造成的。为此,我们利用RBS Calculator（https://www.denovodna.com/software/）构建了梯度初始转运速率（2,000到5,687,190 au）的300个RBS序列,并从中筛选出最适RBS序列,酶活表达量提高到原来的2.09倍。同时我们研究了PYA的分泌情况,通过信号肽预测、蛋白质N端测序等手段发现PYA在枯草芽孢杆菌中的分泌不依赖信号肽,而是通过非经典蛋白质分泌途径（non-classical protein secretion pathway）进行分泌。通过额外添加信号肽并进行筛选,发现最适合该酶在枯草芽孢杆菌中表达的信号肽为Tat分泌途径信号肽SPphoD,并通过共表达分子伴侣PrsA的方式将该L-天冬酰胺酶的分泌量提高到原来的1.52倍。在此基础上,通过培养基优化、发酵过程控制,在5 L发酵罐上实现高产表达,使PYA酶活产量达到6324.23 U?mL-1,是目前报道的最高产量。