论文部分内容阅读
癌症是当前危害人类健康和生命最为严重的的主要常见病、多发病之一。在中国,癌症已经取代心血管疾病成为死亡率最高的疾病,是名副其实的“头号杀手”。从天然生物中筛选出能与癌症发生、发展、形成等过程中各调节靶点特异结合的活性成分,已成为寻找抗癌药物的新热点,也是我国“十一五”期间的生物医药研究的重点方向之一。相比于传统抗癌药物毒副作用大、特异性差、易产生抗性等缺点,生物来源的抗癌活性多肽具有多功能性、功能反应灵敏性、稳定性、高营养价值且低毒副作用、无抗原性、结构简单易于合成等优点。文蛤(Meretrix Meretrix Linnaeus)不仅肉质鲜美、营养丰富,而且具有很高的药用价值。据报道文蛤具有清热利湿、化痰、散结的功效,对肝癌、肺癌、胃癌、甲状腺肿等有明显的抑制作用,而且还能够发挥降糖,降血脂,抗突变、抗衰老等多种生理功能,是一种极具开发潜力的抗癌资源。在优化纯化方案的基础上,本论文采用破碎、有机沉淀、分子筛和HPLC等方法从文蛤中提取了具有抗癌活性的多肽,PAGE电泳显示为单一条带,将它命名为MP1。采用MTT法和细胞计数法分别研究了文蛤多肽MP1对肝癌细胞SMMC-7721、胃癌细胞SGC-7901和BGC-823等多种癌细胞的抑制作用。结果显示,MP1在较低的浓度下就能对上述几种细胞产生明显的抗癌活性,其IC50均低于5μg/mL,具有较好的广谱抗癌活性;结果还表明,经5.0μg/mL文蛤多肽MP1处理的体外培养的人肝癌细胞(SMMC-7721)生长缓慢,倍增时间延长,细胞生长抑制率达89.4%。采用光学显微镜、H.E.染色法、扫描电镜法、透射电镜法及流式细胞技术等方法,初步研究了文蛤多肽对体外培养的肝癌SMMC-7721细胞的细胞形态、显微结构、超微结构及其细胞周期的影响,以期初步探讨文蛤多肽抗癌的分子机理。结果发现:处理后的癌细胞形态发生明显改变,出现了细胞群体数量减少、体积变小、畸形形变、微绒毛减少、贴壁性能减弱、细胞核固缩、染色质新月形并边缘化、产生凋亡小体和出泡现象等一系列凋亡特征的改变。流式细胞技术结果说明,经MP1处理后,SMMC-7721处于G0/G1期和M期的细胞明显减少,而S期细胞增多,并在G0/G1期前出现明显的凋亡峰,凋亡率为9.29%。实验结果说明,文蛤抗癌多肽(MP1)能有效地抑制体外培养肝癌细胞的增殖活动,可通过改变肝癌细胞的形态及细胞周期而明显抑制细胞的增殖,并引起细胞的凋亡。为进一步研究文蛤抗癌多肽抑制癌细胞的分子机制,本论文还利用蛋白组学双向电泳技术初步探讨了在经文蛤抗癌多肽作用前后肝癌细胞SMMC-7721蛋白表达的变化,以期为后续的研究提供理论基础。通过图谱分析找到136个差异蛋白,其中96个表达下调,40个表达上调。对其中部分差异较明显的点进行了鉴定,最终鉴定出11种差异蛋白。其中6个蛋白表达下调,5个蛋白表达上调。这些差异蛋白中有分子伴侣蛋白、细胞骨架蛋白、锌指蛋白、代谢相关蛋白、调控蛋白等。表明经文蛤多肽作用后癌细胞从结构组成及其稳定性到生理代谢都发生了变化。论文最后对部分差异点的功能进行了初步探讨,并尝试提出了文蛤抗癌活性多肽抑制癌细胞的可能途径。