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目的1.通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)直接检测血培养阳性标本中肠杆菌科细菌水解厄他培南的能力,从而快速筛查产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌。2.建立利用MALDI-TOF MS对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)进行分型的方法,从而快速进行CRKP医院感染流行病学分析。3.利用MALDI-TOF MS筛选获得ST11型产KPC-2碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的单个特异峰,快速筛查此类型别肺炎克雷伯菌,从而为临床合理有效治疗和院感控制提供依据。方法1.选取32株产碳青霉烯酶和32株不产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌用于模拟血培养阳性标本,利用MALDI-TOF MS直接检测此类模拟标本中肠杆菌科细菌对厄他培南的水解能力,根据厄他培南及其水解产物质量峰的强度计算logRQ值,并确定其cutoff值。收集385例已检出肠杆菌科细菌的临床血培养阳性标本进行MALDI-TOF MS厄他培南水解试验,并对水解试验阳性的菌株以及水解试验阴性但对碳青霉烯类抗菌药物耐药的菌株进行碳青霉烯酶基因检测。2.选取52株包含25种ST型的CRKP,根据信噪比(S/N)、变异系数(CV系数)以及不同分组的S/N比值确定特异峰挑选标准,并筛选出一系列特异质量峰,随后利用这些特异峰对另外24株包含本实验室常见5种ST型的CRKP进行分型,同时与多位点序列分型(MLST)结果进行比较。3.首先选取118株肺炎克雷伯菌(ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌67株,非该型别的肺炎克雷伯菌51株)作为特异峰筛选组,对血平板上的纯菌落进行蛋白质提取点样后,利用MALDI-TOF MS获得评分≥2.30的质量图谱,通过ClinPro Tools 3.0软件和Flexanalysis 3.0软件筛选出ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的最特异质量峰。其次选取89株肺炎克雷伯菌(ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌37株,非该型别的肺炎克雷伯菌52株),同样的试验方法获取质量图谱,对该特异峰进行验证。最后随机收集95株麦康凯平板上生长的肺炎克雷伯菌且质谱评分≥2.00的临床分离株及其图谱,进一步评估此特异峰的临床应用价值。结果1.在64个模拟血培养阳性标本中,32株不产碳青霉烯酶的菌株logRQ值平均为-0.85±0.14,32株产碳青霉烯酶的菌株logRQ值平均为0.87±0.55,当cutoff值设定为-0.45时,根据logRQ值直接判断肠杆菌科细菌是否产碳青霉烯酶的敏感度和特异度均为100%。收集已检出肠杆菌科细菌的临床血培养阳性标本共385例,其中81.3%(313/385)为碳青霉烯类抗菌药物敏感的肠杆菌科细菌(CSE),logRQ值均小于-0.45,符合率为100%,另外18.7%(72/385)为碳青霉烯类抗菌药物耐药的肠杆菌科细菌(CRE),其中62株的logRQ值大于-0.45,10株logRQ值小于-0.45,这些菌株中67株检出碳青霉烯酶基因,另外5株未检出常见的碳青霉烯酶基因。以碳青霉烯酶基因检测为金标准,利用MALDI-TOF MS厄他培南水解试验直接筛查碳青霉烯酶的特异度和敏感度分别为100%(5/5)和92.5%(62/67)。2.按照标准(1)S/N≥4(2)S/N比值≥1.5(3)CV≤40%,在52株CRKP中共筛选出45个特异峰,利用特异峰对其中的29株CRKP(只选取包含3个或3个以上菌株的ST型)进行分型,与MLST分型结果符合率最高,达82.8%,按照此标准筛选出的特异峰对另外24株CRKP进行分型,与MLST分型结果符合率达83.3%。3.在一定试验条件下,通过MALDI-TOF MS筛选获得ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌的最佳特异峰为m/z 4521,以该峰作为鉴别此型别细菌的特征峰,其特异度和敏感度分别为98.1%和97.3%,且该特异峰的重复性达97.4%。而采用临床常规鉴定图谱对特异峰的临床应用价值进行评估,其特异度和敏感度仍可达95.2%和96.9%。结论1.利用MALDI-TOF MS厄他培南水解试验可快速、准确地筛查血培养阳性标本中肠杆菌科细菌的碳青霉烯酶,为临床早期合理的抗感染治疗提供重要依据。2.利用MALDI-TOF MS筛选出不同ST型CRKP的一系列特异峰,用于CRKP的分子流行病学分析,从而快速有效地监测医院感染的暴发流行。3.微生物实验室在临床日常工作中可依据肺炎克雷伯菌鉴定图谱是否存在特异峰m/z 4521来直接鉴别ST11型产KPC-2肺炎克雷伯菌,从而快速准确地为临床合理有效治疗和院感控制提供依据。