地中海贫血(简称“地贫”)是由珠蛋白基因缺失或突变引起的遗传性溶血性贫血,是全球分布最广、累积人群最多的一种单基因遗传病。地贫目前尚无有效的治疗措施,并且治疗费用较高,因此,地贫人口的出生尤其是中间型和重型地贫患儿的出生给家庭和社会医疗卫生事业带来沉重的负担。地贫虽难治,但可防,做好婚前和孕前人群的地贫基因筛查,若夫妻双方筛查结果为地贫阳性者,再进行产前诊断,此措施可以有效的预防地贫患者的出生。随着PCR(聚合酶链反应)技术的不断完善,基因检测技术已成为地贫诊断的金标准,逐渐代替传统的血液常规检查和血红蛋白电泳技术,临床上常见的地贫基因检测技术包括Gap-PCR(跨越断裂点PCR)、PCR-RDB(反向点杂交)、PCR-流式荧光杂交法、基因芯片、MLPA(多重连接探针扩增技术)等,这些检测技术存在检测型别局限、成本高或无法同时检测缺失型和突变型的缺点。因此开发一种高通量、低成本并可同时检测缺失型和突变型的新技术迫在眉睫。本研究根据α-地贫和β-地贫相关的HBA1、HBA2和HBB三个基因的特点设计一系列引物,同时引入用于识别样本的标签序列。利用多重PCR技术将样本中的HBA1、HBA2和HBB基因扩增富集,将96例样本的PCR产物混合成一个文库,进行文库构建,将制备好的文库在高通量Hiseq2500测序平台上测序,每一条DNA的测序结果经过文库接头序列、样本标签序列和引物序列比对拆分后将被精确定位到每一个样本的每一个扩增区域中。将每个样本和目标区域的测序结果与标准数据库中的各种地贫基因变异类型进行比对分析,从而判断样本中是否存在地贫基因变异以及变异的类型。研究结果如下:(1)成功设计及验证了17条针对地贫缺失型的特异性引物及10条针对地贫突变型的引物,可准确扩增7种地贫缺失型(–α3.7、–α4.2、--SEA、--THAI、SEA-HPFH、中国型和台湾型)和涵盖HbVar数据库所有已知地贫突变型别。(2)成功设计及验证了96套引物标签,实现一次PCR反应检测样本数量由传统的单个样本升级到96个样本,显著提高地贫的检测通量和节约成本。(3)成功建立了多重PCR反应的引物组合、反应体系和反应程序。在5个多重PCR反应中准确有效的扩增出地贫突变型和缺失型基因,与普通PCR需要11个PCR反应相比,本研究简化实验操作和节约检测成本。(4)为了验证本研究技术的可行性,选择已知结果的临床样本748例(包括452例阳性样本,290例阴性样本)进行实验,710例样本得出地贫分型结果,38例(5%)样本检测失败。经比对,710例样本分型结果符合率为100%,38例失败的样本重新实验之后,均得出准确的地贫分型结果。选择5例已经结果的样本重复10次分型实验,10次分型结果均与已知结果一致。因此,本研究开发的基于高通量测序平台同时检测地贫缺失型和突变型的方法具有高通量,高准确性,检测型别种类多并可发现新的突变型等特点,适合于大规模人群的地贫基因筛查。