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SVBV能够在草莓叶肉细胞内形成含病毒粒子的内含体,为了鉴定内含体的组成,在本氏烟中异位表达了SVBV的6个阅读框,结果显示,只有P6蛋白能够自身聚集,形成大小不一的不定型内含体,在细胞核和细胞质中均有分布。利用荧光蛋白标记微管、微丝和内质网,发现P6内含体能排列在微管和内质网上,并且可以沿着微丝移动。另外,P6蛋白和P1蛋白能够共定位在细胞边界上,说明携带病毒粒子的内含体可能是通过细胞骨架到达细胞边界的。而P6蛋白的核定位信号缺失突变体不能被运输进细胞核,也不能在细胞质中形成内含体,并且丧失促进外源基因GFP表达的能力,因此,认为P6蛋白的核定位信号是其行使生物功能的一个重要功能域。1 SVBV P6蛋白能够形成内含体构建p CAM-P1-YFP、p CAM-P2-GFP、p CAM-P3-GFP、p CAM-P4-GFP、p CAM-P5-GFP和p CAM-P6-GFP的双元表达载体。转化农杆菌后浸润本氏烟叶片,发现SVBV各ORF能够在细胞质中产生不同的荧光信号。P1-GFP能够在细胞边界上形成点状结构。P2-GFP在有些细胞中呈丝状分布,但是在另外一部分细胞中同时呈现丝状和点状分布。P3-GFP沿着细胞膜分布。P4-GFP和P5-GFP的荧光分布与单独表达GFP相似,绿色荧光均匀分布在细胞边界上。P6-GFP在细胞中形成大小不一、不规则的内含体,表明P6蛋白是SVBV侵染的寄主细胞中内含体的重要成分。2 SVBV P6内含体能定位在细胞核、细胞骨架和内质网,但不能与叶绿体共定位含p CAM-P6-GFP的农杆菌浸润本氏烟,将浸润的组织用DAPI染色,结果表明,P6蛋白能定位在细胞核上,同时细胞质中也存在内含体。为了进一步验证较小的内含体的定位情况,将能表达微丝标签蛋白、微管标签蛋白、内质网标签蛋白的农杆菌分别和含p CAM-P6-GFP的农杆菌共浸润本氏烟,激光共聚焦荧光显微镜观察发现,带有绿色荧光标签的P6内含体能够够排列在绿色荧光标记的微丝、红色荧光标记的微管和内质网上。然而,GFP标记的内含体与叶绿体的自发荧光并不能共定位,多数P6包涵体存在于叶绿体的缝隙之间。表明P6蛋白在细胞中形成一个大的内含体定位在细胞核上,而产生的较小的内含体定位在细胞骨架和内质网上,与叶绿体无明显的定位关系。3 SVBV P6内含体沿着微丝移动并且与P1共定位在细胞边界上含p CAM-P6-GFP的农杆菌和能表达微丝标记基因的农杆菌共浸润本氏烟,发现P6内含体沿着微丝移动,可以从微丝的一端运动到另外一端,并且内含体在运动过程中,微丝能够保持稳定。p CAM-P6-RFP和p CAM-P1-YFP共浸润本氏烟,结果发现,P6蛋白与P1蛋白共定位在细胞边界上,推测P6蛋白携带病毒粒子沿着微丝移动到细胞边界,与定位在胞间连丝上的运动蛋白共定位。4 SVBV P6蛋白与SVBV编码的其他蛋白间的互作酵母双杂交验证SVBV P6蛋白与SVBV编码其他蛋白间的互作。质粒AD-P6与BK-P1和BK-P6与AD-P1分别共转化酵母,但是转化后的酵母并不能在四缺板上正常生长,然而阳性对照在四缺板上生长良好,表明P6蛋白与P1蛋白不能互作。用同样的方法验证P6和P3之间的互作关系,结果表明,P6蛋白与其自身编码的P1和P3都不互作。5 SVBV P6蛋白的25个氨基酸影响其核定位功能及内含体的形成利用核定位分析软件预测P6的核定位信号,发现2个核定位信号分别位于P6蛋白的193 aa-223 aa和402 aa-426 aa。为了验证预测结果的可靠性,构建了2个P6蛋白核定位信号的缺失突变体M1(缺失193 aa-223 aa)和M2(缺失402 aa-426 aa),分别浸润本氏烟叶片,结果显示,大约有50%的细胞中M1形成的大内含体可以定位在细胞核上,其余细胞M1形成的大内含体定位在邻近细胞核的位置,M1依旧可以形成细胞质小内含体。M2不能进入细胞核,在细胞内也不能形成内含体。证明402 aa-426 aa是主要的核定位信号。利用Simian vacuolating virus 40(SV40)的核定位信号回补M2(M5),发现SV40核定位信号能够回复M2的核定位功能,P6蛋白全部进入细胞核中。进一步构建了不含有25个aa的突变体M3(1 aa-401 aa)和含有25个aa突变体M4(1 aa-426 aa),发现这2个突变体荧光分布与M2相似,均不能定位在细胞核,也不能在细胞质中形成包涵体。表明这25个aa虽然对P6内含体的形成非常重要,但不是形成P6内含体的决定性功能域,推测P6蛋白426 aa下游的的区域也可能参与包涵体的形成。6 SVBV P6蛋白的25个氨基酸影响P6促进外源基因GFP表达P6、M1和M2分别与GFP共浸润本氏烟叶片,发现浸润P6和M1的本氏烟叶片和浸润阳性对照P19一样,均表现出强烈的绿色荧光;而浸润M2的本氏烟叶片绿色荧光明显较弱,和浸润空载体的荧光强度一致,说明缺失25个aa的突变体M2丧失了促进外源基因GFP表达的能力。Northern blot和Western blot检测发现,浸润P6和M1的本氏烟叶片中GFP的核酸和蛋白表达水平均较高,而浸润M2的本氏烟叶片中GFP的的核酸和蛋白表达水平显著降低。SV40核定位信号回补M2(M5),将M5与GFP共浸润本氏烟叶片,发现M5和M2一样不能促进外源基因GFP的表达,说明含有SV40核定位功能的P6突变体并不能行使P6蛋白促进外源基因表达的能力。M5完全定位于细胞核,而P6不仅定位于细胞核,而且在细胞质中形成内含体,暗示P6蛋白促进外源基因的表达过程可能是在细胞质中进行的。