论文部分内容阅读
背景:免疫系统紊乱和恒定自然杀伤T（Invariant natural killer T,iNKT）细胞过度激活可引起肝细胞损伤。免疫性肝损伤与葡萄糖神经酰胺合成酶（Glucosylceramide synthase,GCS）的活性有关,该酶是催化神经酰胺（Ceramide,Cer）糖基化生成葡萄糖神经酰胺（Glucosylceramide,Glu Cer）的关键酶,其活性改变会引起细胞内鞘脂代谢紊乱。iNKT细胞在肝脏中明显富集,其可通过识别糖脂类抗原以活化并参与调节先天免疫和适应性免疫。因此,GCS可通过引起糖鞘脂发生改变进而影响iNKT细胞功能,导致机体免疫功能障碍并可致病。本研究旨在探讨GCS在iNKT细胞介导的免疫性肝损伤中的作用及其相关调节机制。目的:研究GCS对刀豆蛋白A（Concanavalin A,Con A）诱导的小鼠免疫性肝损伤结局的影响及其相关机制。方法:使用Con A建立小鼠免疫性肝损伤模型,然后对小鼠预先给予基因和化学药物干预以抑制其GCS表达,观察各组小鼠丙氨酸氨基转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase,AST）水平、肝脏病理学变化、Th1/Th2/Th17细胞因子水平、GCS表达、Cer和Glu Cer水平、肝细胞超微结构改变以及肝细胞自噬/凋亡情况。随后进一步分析小鼠肝脏中淋巴细胞各亚型如T淋巴细胞、NKT细胞和iNKT细胞等数量和活化情况。接下来对iNKT细胞进行流式分选和体外培养,并使用α-半乳糖神经酰胺（α-galactosylceramide,α-Gal Cer）刺激iNKT细胞活化。在iNKT细胞活化的基础上预先抑制核因子-κB（Nuclear factor-kappa B,NF-κB）信号通路或GCS或二者同时抑制,随后分别检测iNKT细胞活化水平、NF-κB信号通路激活情况、GCS和细胞因子表达水平,以及iNKT细胞与原代肝细胞共培养后检测培养上清中ALT、AST、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase,LDH）、丙二醛（Malondialdehyde,MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）水平。然后使用Genz-123346（GCS的特异性抑制剂）和/或4-苯基丁酸（内质网应激抑制剂）干预共培养的原代肝细胞,并检测各组细胞活性、细胞损伤指标变化、葡萄糖调节蛋白78（Glucose regulated protein 78,GRP78）、p NF-κB p65/NF-κB p65比值、LC3BII/LC3BI比值、Cleaved caspase-3和caspase-12等蛋白表达。结果:Con A组（模型组）小鼠血清ALT、AST和Th1/Th2/Th17细胞因子（除IL-17A外）水平,肝脏中GCS基因与蛋白、Glu Cer以及细胞自噬/凋亡等较对照组显著升高（P均＜0.05）,且肝组织病理和透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）结果均提示肝脏/肝细胞发生了明显损伤。抑制GCS后上述指标（除IL-17A外）均有改善（P均＜0.05）,但肝细胞自噬/凋亡除外,其反而增加了（P均＜0.05）;而GCS高表达组呈现出与GCS抑制组完全相反的结果。流式细胞学分析显示各组小鼠LMNC、淋巴细胞和T淋巴细胞总数无差异（P均＞0.05）。进一步分析显示模型组小鼠肝脏中NKT细胞总数和iNKT细胞的活化较对照组显著升高（P均＜0.001）,抑制GCS后NKT细胞总数、iNKT细胞的数量和活化水平有所下降（P均＜0.01）。使用α-Gal Cer激活iNKT细胞后,p NF-κB p65/NF-κB p65比值和肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）、白细胞介素-4（Interleukin-4,IL-4）等细胞因子处于高水平,然而抑制NF-κB信号通路和或GCS后iNKT细胞活化减少（P均＜0.001）,同时p NF-κB p65/NF-κB p65比值和TNF-α、IFN-γ、IL-4等细胞因子表达降低（P均＜0.01）。活化的iNKT细胞与原代肝细胞共培养后引起ALT、AST、LDH和MDA明显升高,抑制iNKT细胞NF-κB和或GCS后原代肝细胞ALT、AST、LDH和MDA明显降低（P均＜0.01）。细胞计数试剂盒-8（Cell counting kit-8,CCK-8）结果显示抑制正常组和共培养组原代肝细胞GCS后其活性明显降低（P均＜0.001）,此外,抑制原代肝细胞GCS后其GRP78蛋白、LC3BII/LC3BI比值、p NF-κB p65/NF-κB p65比值、Cleaved caspase-3蛋白和caspase-12蛋白明显升高（P均＜0.05）。然而,在抑制GCS的基础上使用4-苯基丁酸处理后提高了原代肝细胞活性（P均＜0.001）,且其GRP78蛋白、LC3BII/LC3BI比值、p NF-κB p65/NF-κB p65比值、Cleaved caspase-3蛋白和caspase-12蛋白显著下降（P均＜0.05）。进一步的研究表明,抑制正常组原代肝细胞GCS或使用4-苯基丁酸干预对其ALT无影响（P均＞0.05）,然而,抑制共培养组原代肝细胞GCS后降低了ALT水平,使用4-苯基丁酸后其ALT水平出现了上升（P均＜0.05）。结论:GCS通过抑制NF-κB信号通路阻碍了iNKT细胞的活化,并能触发内质网应激介导的肝细胞自噬/凋亡,从而改善iNKT细胞介导的免疫性肝损伤结局。