腈水合酶(EC 4.2.1.84)是一种可以将腈类物质转化为酰胺类物质的酶,如:在全细胞或者游离腈水合酶的催化作用下,丙烯腈可以转化为丙烯酰胺,3-氰基吡啶可以转化为烟酰胺。酰胺类物质在有机合成、医药、农药等方面有着十分重要的应用。同全细胞相比,游离的腈水合酶更受青睐,因为它具有严格的化学、区域和对映选择性及底物专一性。但是,游离酶的使用通常会因为价格昂贵、稳定性低、难以回收利用等因素受到限制。酶经固定化后可在一定程度上提高酶的耐受性,能够重复使用,方便下游过程的操作。交联酶聚集体技术是一个操作简单、成本低廉、应用广泛的无载体固定化酶技术。本论文采用大分子交联剂葡聚糖醛代替戊二醛制备腈水合酶交联酶聚集体,在此基础上,将交联酶聚集体技术同球化酶技术结合,能使固定化酶具有规则的、可控性好的形貌,也能改善操作过程中难分散的问题。本论文主要研究内容如下:(1)利用交联酶聚集体技术,采用葡聚糖醛作为交联剂,对腈水合酶进行固定化。优化了沉淀剂种类、沉淀剂用量、交联剂用量和交联时间等固定化条件,获得腈水合酶交联酶聚集体,酶活回收率为49.63%。考察了酶的稳定性,同游离酶相比,固定化酶有更好的pH、热和储藏稳定性、对高浓度底物的耐受性。在重复使用8次后,仍保留了初始酶活的47.67%。经过动力学实验测试,腈水合酶交联酶聚集体对底物的亲和性没有太大改变。(2)利用球化酶技术制备了蛋清蛋白微球,并用葡聚糖醛将酶交联在蛋白球外部。经过条件优化,制备了粒径在8-20μm的球化酶,酶活回收率超过50%。球化酶和游离酶相比,有更高的稳定性和耐受性。(3)在最适条件下制备了两种固定化酶,并应用于催化3-氰基吡啶生成烟酰胺的反应中。底物浓度为50 mmol/L时,1.6 mg/m L的酶催化效率较高,在pH 7,30 oC下固定化酶能稳定的催化反应。在底物浓度为50 mmol/L时,两种固定化酶表现了较好的重复使用性,反应10次后,交联酶聚集体和球化酶的酶活分别为初始酶活的73.45%和61.26%。