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目的(1)分析人正常乳腺组织,乳腺癌组织及乳腺癌细胞系中Mfn2和EGFR的表达情况,奠定本课题所做推测的基础,从而探讨Mfn2在乳腺癌侵袭、转移中的作用。(2)利用基因转染技术调控乳腺癌细胞系MCF-7中Mfn2表达水平,并且观察转染Mfn2后MCF-7的增殖情况。(3)检测转染Mfn2后MCF-7中EGFR的变化情况,从而分析Mfn2影响EGFR改变的机制,并初步研究基因治疗对乳腺癌的影响,以探讨Mfn2成为治疗靶点的可能性。方法(1)采用RT-PCR法检测正常乳腺组织,乳腺癌组织和乳腺癌细胞MCF-7中Mfn2和EGFR的表达状况。采用免疫细胞化学法检测乳腺癌细胞系MCF-7中Mfn2和EGFR的蛋白表达状况。(2)构建一种包含全长Mfn2基因开放阅读框(open reading frame, ORF)序列的真核表达载体,将含有mfn2 cDNA的质粒在脂质体的介导下体外转染MCF-7细胞。(3) RT-PCR检测转染后MCF-7中Mfn2的表达,MTT法检测Mfn2对MCF-7细胞增殖的影响,流式细胞术检测转染效率和转染后对MCF-7细胞周期分布的影响。(4)用免疫细胞化学和实时荧光定量PCR法检测转染Mfn2 48h后MCF-7中EGFR的变化情况。结果(1)琼脂糖凝胶电泳显示:检测的目的条带大小143bp, HGADPH为296bp。Mfn2在正常乳腺组织,乳腺癌组织和乳腺癌细胞MCF-7均有表达,但在乳腺癌及乳腺癌细胞中的表达明显低于乳腺组织中的表达;EGFR在乳腺癌细胞系MCF-7中呈高表达。(2)重组后的pEGFP-N1质粒已成功载入小鼠Mfn2的全长编码基因,DNA序列测定的结果与预期设计基本一致。普通PCR琼脂糖凝胶电泳显示转染后MCF-7细胞中存在外源性Mfn2的表达。(3)琼脂糖凝胶电泳检测显示实验组中Mfn2较对照组明显升高,转染Mfn2后MTT法检测转染pEGFP-mfn2组的MCF-7细胞数明显低于空白对照组与转染pEGFP-N1组(P<0.05),转染后48h用流式细胞术DNA直方图分析测定三组细胞显示,G1期细胞比例显著升高,差异具有显著统计学意义(F=49.299, P<0.05),转染PEGFP-mfn2组与转染pEGFP-N1组及空白对照组相比(P<0.05),转染pEGFP-N1组及空白组相比,差异均无统计学意义(P=0.327)。(4)细胞免疫化学和实时荧光定量PCR结果均显示转染Mfn2后MCF-7细胞数目减少,癌细胞出现核碎裂现象,EGFR表达水平较转染空质粒组明显下降。结论(1) Mfn2在乳腺癌组织、乳腺癌细胞中的表达明显低于正常乳腺组织中的表达,考虑Mfn2在肿瘤细胞中表达的降低是否可以认为是促进细胞增殖的一个重要机制,初步推测Mfn2可能为一种新的抑癌基因;同时验证了EGFR作为肿瘤相关因子,在乳腺癌中呈现强表达。(2)成功构建了真核表达质粒pEGFP-Mfn2,并成功转染MCF-7细胞。(3)转染Mfn2后48h,MCF-7细胞的增殖受到明显抑制,细胞周期停滞在G1期。(4)转染Mfn2可使MCF-7细胞发生凋亡,并使EGFR的表达下降。