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目的:探讨通过RNA干扰技术沉默MRP1基因对人肺癌A549/DDP细胞多药耐药的逆转效果。方法:针对MRP1 mRNA序列设计合成2对编码shRNA的DNA模板序列,定向克隆到pSicencer-2.1-U6 neo质粒载体上,构建2种表达shRNA的重组载体,经测序鉴定后电转染A549/DDP细胞,经G418筛选后制备转染细胞单克隆,经PCR扩增基因组DNA鉴定和流式细胞术检测MRP1蛋白表达水平筛选单克隆后扩大培养。通过荧光定量PCR检测MRP1 mRNA表达水平、流式细胞术、免疫荧光检测MRP1蛋白表达水平,通过MTT法检测细胞对化疗药物的敏感性,通过流式细胞术检测细胞凋亡率、细胞周期变化和在荧光显微镜下及琼脂糖凝胶电泳时,药物作用后细胞呈现的形态结构和生化特征,从而检测细胞耐药逆转效果。结果:1.用pSicencer-2.1-U6 neo质粒成功构建了2种表达shRNA的重组载体,即p2.1-1和p2.1-2;2.重组载体成功转染A549/DDP细胞,获得了稳定转染细胞单克隆;3.荧光定量PCR和流式细胞术检测结果显示,2对干涉片段(2种重组载体)均能不同程度地抑制A549/DDP细胞MRP1基因表达,MRP1 mRNA抑制率分别为52.11±0.00%、44.97±0.81%;流式细胞术结果表明多药耐药相关蛋白表达抑制率分别为59.83±1.44%,36.19±0.74%,免疫荧光结果显示多药耐药相关蛋白表达率明显下降,干涉片段1的抑制作用优于干涉片段2,使细胞周期发生改变,细胞凋亡率升高;4.Rho123外排实验结果显示,2种重组载体转染的A549/DDP细胞MRP1蛋白的外排转运功能均有不同程度降低;5.MTT检测结果显示,转染2种重组质粒的A549/DDP细胞对顺铂和五氟尿嘧啶的敏感性增强,耐药性均有不同程度逆转,单克隆A549/DDP/sh-MRP1-p2.1-1-1和A549/DDP/sh-MRP1- p2.1-2-1对顺铂的相对逆转率分别为79.35±1.86%、59.74±0.64%,对五氟尿嘧啶的相对逆转率分别为78.55±0.59%、57.93±1.80%;6.在荧光显微镜下以及琼脂糖凝胶电泳时,用顺铂和五氟尿嘧啶作用后,转染p2.1-1和p2.1-2重组质粒的A549/DDP细胞均呈现明显的凋亡特征。结论:本实验设计的2对编码shRNA的DNA干扰片段所构建的重组载体均能转染A549/DDP细胞,并能不同程度地抑制A549/DDP细胞MRP1基因的表达,不同程度地逆转A549/DDP细胞的耐药性,干扰片段sh-MRP1-p2.1-1优于干扰片段sh-MRP1- p2.1-2,转染细胞单克隆间存在逆转差异。