随着人口老龄化的出现,阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的发病率呈明显上升趋势,预测到2050年将超过9000万。由于缺乏有效的预防、诊断和治疗措施,AD已成为死亡病因的第四位。AD是以进行性认知功能减退为关键临床特征,以大量老年斑形成、神经元纤维缠结和胆碱能神经元缺失为病理学特征的神经系统退行性疾病。β淀粉肽(β-amyloid peptide, Aβ)是老年斑的主要成分。Aβ损害胆碱能神经系统被认为是AD早期认知障碍的病理机制之一。研究证明,α7烟碱型乙酰胆碱能受体(α7nicotinic acetylcholine receptor, α7nAChR)是Ap的靶蛋白。Ap与α7nAChR结合,不仅能损害α7nAChR的功能,同时也能增加Ap的积聚和沉积,增强Ap的神经毒作用。本实验室的前期研究报道,Aβ25-35侧脑室注射能损伤海马的α7nAChR,导致认知功能障碍。此外,Aβ还能通过破坏神经细胞内钙稳态,产生大量自由基,激活细胞凋亡信号通路等引起神经细胞的大量死亡成年哺乳动物的神经干细胞可以分化为神经细胞——成年神经发生。海马齿状回(dentate gyrus, DG)的新生神经细胞与成熟颗粒细胞具有相同的形态和功能特征,能与CA3区神经元和内嗅皮层的传入纤维建立突触联系,产生突触传递功能。海马DG的神经发生已被证实与空间认知行为密切相关,即增加新生神经细胞数量能提高学习记忆功能,而阻碍成年神经发生则造成记忆功能减退。我们的前期研究结果显示,Aβ能损伤新生神经细胞的突起生长,导致成熟的新生神经细胞数量明显减少。我们还报道了Aβ通过下调信号分子1mTOR(mammalian target of rapamycin),抑制新生神经细胞的突起生长。这些结果提示,Aβ损害神经再生可能是AD患者认知行为进行性减退的重要病理机制之一。神经甾体激素硫化孕烯醇酮(pregnenolone sulfate, PREGS)的脑内水平被认为与AD的发病率、老年斑的形成呈负性相关。AD患者脑内PREGS水平明显低于同龄非认知障碍人群。我们的前期研究结果发现,PREGS体外给药能改善Aβ大鼠的认知功能,但是有关其机制尚不清楚。大量的研究报道,PREGS是N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDA-R)的正性调节剂,γ-氨基丁酸A型受体(y-aminobutyric acid type A receptor, GABAAR)的负性调节剂。PREGS能够增强α7nAChR功能,促进海马神经元的谷氨酸释放。此外,PREGS还能激活sigma-1受体(sigma-1receptor, σ1R)。 σlR激动剂PRE084通过上调P13K(phosphatidylinositol-3-kinase)—Akt信号通路,能阻止Aβ下调mTOR—p70S6k(70kDa ribosomal protein S6kinase)信号分子的磷酸化水平,保护新生神经细胞的突起生长。早期的研究已报道,PREGS通过抑制GABAAR活性,能促进神经干细胞的增殖。此外,NMDA-R的功能活性也已经被证明与新生神经元的存活、成熟和神经回路的整合密切相关。我们的前期研究已证明了a7nAChR激动剂DMXB能剂量依赖地阻止Aβ损害a7nAChR功能,保护海马的突触传递功能和可塑性,改善Aβ痴呆小鼠的认知功能。本课题将重点研究PREGS对Aβ损害神经再生、Aβ诱导神经细胞凋亡的影响及其分子机制,以系统地阐明PREGS改善Aβ痴呆小鼠认知行为的机制,为PREGS能用于AD的预防和治疗提供理论依据。研究目的1.明确PREGS对Aβ损害神经再生的作用及其调控机制；2.明确PREGS对Aβ诱导神经细胞凋亡的作用及其分子机制。第一部分PREGS对Aβ损害神经再生的作用及其调控机制材料与方法1.动物模型：8月龄雄性APPswe/PS1dE9转基因(APP/PS1)小鼠的基因型鉴定。部分机制研究采用雄性ICR小鼠(25-30g)。2. PREGS处理-新生细胞标记：(1) APP/PS1小鼠：用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine, BrdU)连续12天腹腔注射标记有丝分裂细胞。从BrdU注射前7天开始给予PREGS(20mg/kg/day)的皮下注射,连续34天。分别在BrdU末次注射后24小时(1天龄)或第28天(28天龄),进行BrdU免疫组织化学染色。(2)ICR小鼠：BrdU间隔6小时连续3次注射。BrdU给药的当天记为BrdU的第0天。在BrdU给药后的第0-1天、5-6天、10-11天、15-16天或20-21天分别给予连续2天的PREGS(3nmol)侧脑室注射。在BrdU给药后的第22天(22天龄)进行BrdU免疫组织化学染色。3.增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, Ki67)免疫染色：检测干细胞增殖。4. DCX (Doublecortin)免疫染色：测量新生神经细胞的突起长度。5. BrdU与神经特异性核蛋白(neuron specific protein, NeuN)或胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)双标记免疫荧光染色：检测神经前体细胞的分化和新生神经元的存活和成熟。6.Aβ免疫染色：检测老年斑。7.酶联免疫吸附实验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA):检测海马脑源性生长因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)。8.场电位记录：ICR小鼠给予PREGS腹腔注射60min后取脑,制作海马脑片,检测海马DG的兴奋性突触后电位(excitatory post-synaptic potentiation, EPSP)和双脉冲易化(paired-pulse facilitation, PPF)。9. Morris水迷宫：检测空间认知功能。结果1.与同窝或同周龄的野生型对照组小鼠相比,8月龄APP/PS1小鼠的海马区域出现大量的老年斑,并表现水迷宫登台潜伏期的明显延长。2.与对照组小鼠相比,APP/PS1小鼠海马DG的1天龄BrdU免疫阳性(BrdU+)细胞数量增加约30%,Ki67免疫阳性(Ki67+)细胞数量显著增加,提示Aβ刺激干细胞的增殖。PREGS处理不影响APP/PS1小鼠的神经干细胞过增殖。3.与对照组小鼠相比,APP/PS1小鼠DCX免疫阳性(DCX+)细胞突起长度显著减小。PREGS处理能保护APP/PS1小鼠新生神经元的突起生长。4.与对照组小鼠相比,APP/PS1小鼠28天龄BrdU+细胞数量减少约50%,BrdU和NeuN免疫双阳性(BrdU+/NeuN+)细胞数量显著减少,而BrdU和GFAP免疫双阳性(BrdU+/GFAP+)细胞数量没有改变,提示Aβ损害新生神经元的存活和成熟。PREGS处理能增加APP/PS1小鼠成熟新生神经元的数量。5. PREGS能减少APP/PS1小鼠脑Ap的沉积。6. PREGS能改善APP/PS1小鼠海马BDNF水平的降低。7.在ICR小鼠,BrdU注射后的第10-16天PREGS处理能引起22天龄BrdU+细胞数量增加。PREGS能引起EPSP斜率的持续性增加和双脉冲比率(paired-pulse ratio, PPR)的降低,提示突触前神经递质的释放增加。a7nAChR拮抗剂、σ1R拮抗剂或NMDA-R拮抗剂的前处理都能抑制PREGS促进突触前神经递质释放和促新生神经元存活的作用,提示PREGS通过增强向新生神经元的兴奋性传入,减少非活性化新生神经元的死亡。8. PREGS能改善APP/PS1小鼠的水迷宫登台潜伏期延长。结论1. PREGS通过减少Aβ沉积和提高BDNF水平,能阻止Aβ损害新生神经元突起生长和存活。2. PREGS增加向新生神经元的传入神经兴奋,减少非活性新生神经元的死亡,促进新生神经元的存活和成熟。3. PREGS通过保护Aβ小鼠的神经再生,可以改善Aβ痴呆小鼠的认知行为。第二部分PREGS对Aβ诱导神经细胞凋亡的作用及其分子机制材料与方法1.动物模型：Aβ25-35(9nmol)进行侧脑室注射制备Aβ痴呆小鼠模型。2.药物处理：从Aβ给药后第二天开始连续7天腹腔注射PREGS(20mg/kg/day)。3. Morris水迷宫：检测空间记忆功能。4.组织细胞检查：海马CA1区神经细胞计数。5. TUNEL染色：检查细胞凋亡6. Western blot:分析ERK1/2、Akt磷酸化水平和caspase-3。结果1.与对照组小鼠相比,Aβ25-35小鼠水迷宫登台潜伏期明显延长,海马CA1区神经细胞数量减少和TUNEL阳性细胞明显增加。2. PREGS处理能改善Aβ25-35小鼠的登台潜伏期延长,减少海马CA1区神经细胞的凋亡3.σ1R拮抗剂NE100、a7nAChR拮抗剂MLA能阻止PREGS的抗凋亡作用。4.与对照组相比,Aβ25-35小鼠海马的ERK2和Akt磷酸化水平减少,caspase-3增加。PREGS处理能增加Aβ25-35小鼠的ERK2和Akt磷酸化水平,降低caspase-3。5.σ1R拮抗剂NE100能阻断PREGS对ERK2、Akt和caspase-3的调节,而a7nAChR拮抗剂MLA只能阻断PREGS对Akt和caspase-3调节。6.ERK抑制剂U0126.PI3K抑制剂LY294002能阻断PREGS对Aβ25-35小鼠的抗凋亡作用。7.P13K抑制剂LY294002能阻止PREGS改善Aβ25-35痴呆小鼠的认知行为。结论1.Aβ抑制细胞保护因子ERK2和抗凋亡因子Akt的活性,激活caspase-3促进海马神经元凋亡2. PREGS通过激活σ1R介导的PI3k-Akt和ERK信号通路,同时启动a7nAChR介导PI3k-Akt的信号通路,阻止Ap的神经毒性,以改善Aβ25-35小鼠的认知行为。