棉花黄萎病是一种土传病害,在我国主要是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliaeKleb.)引起的。病害广泛分布于棉花产区,常造成严重的经济损失,已成为棉花产业发展的主要障碍。大丽轮枝菌在土壤中主要以微菌核形式存在,可在土壤中存活多年,是生产上最难防治的病害之一。棉花生产上迄今缺乏高抗棉花黄萎病的抗病品种,病害防治长期依赖于化学农药。随着人们对化学农药残留对环境和人类负面影响的深入了解,病害的生物防治日益受到重视。因此,本研究试图从土壤中筛选出防治棉花黄萎病的高效生防菌株,通过形态和分子序列鉴定,并测定其防治效果,明确其生物学特性,为生防菌株的应用奠定基础。另外,在分离棉花黄萎病菌的过程中,经常分离到帚霉属的一个真菌。该菌形态学上不属于已知的帚霉属的种类,也不包含在已知棉花内生菌的名单中。为此,通过形态学与分子系统学方法鉴定了该真菌,并测定了其致病力,明确了其与棉花黄萎病病原菌协同致病力作用。1、棉花黄萎病生防菌的筛选1)通过双层平板法初筛获得5个对大丽轮枝菌具有抑制效果的菌株,经进一步琼脂扩散法试验,获得抑制效果最好的1个菌株SX-3。形态学特征结合16S序列分析以及脂肪酸测定,该菌株被鉴定为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。2)通过琼脂扩散法测定了生防菌株SX-3对其它几个病原菌的抑制效果,结果显示,多粘类芽孢杆菌SX-3对多个植物病原菌具有活性。但对不同病原菌的菌丝生长抑制率有一定差异。对平头炭疽菌炭疽病菌(Colletotrichum truncatum)的抑制率最高(75.00%),而对核盘菌(Sclerotinia Sclerotiorum)的抑制率最低(59.52%)。对灰霉菌(Botrytiscinerea)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)以及尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的菌丝生长抑制率分别为73.02%,72.22%,70.63%和69.84%,它们之间无显著差异。3)防治棉花黄萎病的盆栽试验显示,生防菌株SX-3能延迟病害发生7天左右,有效降低发病率76.9%,防病效果达74.9%。另外,还发现菌株SX-3可以促进植物生物量的增加,包括干重、鲜重、株高等,尤其可促进根系生长,与对照相比,根部干重、鲜重分别增加了 38.5%和47.8%。4)通过测定生防菌株SX-3营养生长最适温度、pH以及芽孢形成的最适温度、培养基和培养时间,结果表明,该菌株最适营养生长温度是37℃、pH7.0。而最适芽孢形成温度为30℃、最适培养时间和最适培养基分别为30小时和NBS培养基。当温度超过37℃后不能形成芽孢。2、棉花黄萎病一个新病原菌的发现1)通过从棉花黄萎病病株和健康植株中系统分离内生菌,结果显示,棉花黄萎病病株上共获得209个分离系,健康植株上共获得82个分离系。经菌落形态并结合初步分子生物学鉴定,在病株中,90个分离系是大丽轮枝菌Verticillium dahliae,30个是帚霉属种Scopulariopsis sp.,89个是其它真菌。而在健康植物上,没有帚霉属的种类,均为其他内生真菌。2)对分离得到的帚霉属的种,用大亚基(LSU)序列、延长因子(EF-1α)和beta-tubulin基因以及下载的相应同源序列,采用最大似然法和贝叶斯法分别构建系统发育树,并结合该菌的形态学特征进行分析,发现该菌是帚霉属的一个新种,被鉴定为棉帚霉(Scopulariopsis gossypii sp.nov.)。3)致病力试验结果表明,大丽轮枝菌与棉帚霉菌混合接种比单独接种大丽轮枝菌发病早、发病程度更加严重,尤其促进了落叶。相比较,仅有伤接种棉帚霉的处理有叶脉失绿症状,而无伤接种棉帚霉的处理无任何症状。各处理植株通过纵切解剖观察发现,不同处理间维管束褐变程度不同。混合接种处理中,整个维管束呈黑褐色,显然比单独接种大丽轮枝菌的处理症状更严重,而单独接种棉帚霉的处理只有部分维管束轻度褐变。清水对照和无伤接种棉帚霉对照中维管束无褐变现象。