马传染性贫血病病毒(EIAV)，慢病毒属成员，主要引起马属动物慢性、终生感染，以周期性发热、病毒血症、贫血和血小板减少为特征。70年代，EIAV弱毒疫苗通过以下策略成功研制：首先，将马强毒EIAV-L经过驴体体内传代113次，获得了高毒力的驴强毒EIAV-DA；然后，将EIAV-DA经驴白细胞体外传125代，获得弱毒疫苗EIAV-DLA，该疫苗可保护马和驴免受同源和异源的野生型高毒力EIAV的攻击。中国EIAV的弱化过程可以为研究其他慢病毒疫苗提供有益借鉴，然而EIAV-L和EIAV-DLA的分子生物学特性还有待澄清。基于这个原因，本研究中将7匹试验马分别接种EIAV-DLA、vOK8266、vOK8266chltr或者空白对照，之后用EIAV-L对所有试验马进行攻击。vOK8266是EIAV-DLA的感染性分子克隆(命名为pOK8266)的衍生病毒。将pOK8266的5’和3’LTR替换成EIAV-L的5’和3’LTR得到嵌合感染性分子克隆(命名为pOK8266chltr)，vOK8266chltr则是pOK8266chltr的衍生病毒。攻毒前后，对每种病毒的体内复制动力学以及抗gp45、p15、p26、p11和p9抗体进行定期监测。此外，对于EIAV两个重要的基因长末端重复序列(LTR)和表面糖蛋白(gp90)的基因型与表型的关系进行探讨。具体研究内容如下：1、免疫期和攻毒期观察试验马EIA疾病进展7匹血清抗EIAV抗体阴性马分别命名为1#、2#、4#、5#，6#、7#和8#。4#和5#接种克隆毒vOK8266，6#和7#接种嵌合毒vOK8266chltr，8#接种疫苗毒EIAV-DLA，1#和2#为接种对照。6个月后，对5匹接种马和2匹接种对照马以野生型强毒EIAV-L攻击。攻毒前后，每天观察各试验马直肠温度和临床症状。免疫期的6个月中，各试验马没有出现发热现象，表明各接种毒株对试验马是安全的，即使vOK8266chltr的LTR是来源于强毒EIAV-L的。攻毒后，1#、2#和7#出现典型的马传贫症状，经过数个发热期后死亡，其余各试验马在攻毒后13个月的观察期内没有出现任何发病症状。2、马体内EIAV的复制动力学为了研究每种病毒在试验马体内的复制情况，攻毒前后对各试验马血浆中病毒RNA载量和外周血单核细胞(PBMC)前病毒DNA载量进行了定期检测。进行检测之前，首先建立了用于检测EIAV基因组的realtime PCR和realtime RT-PCR的标准曲线。攻毒前的大多数时期，vOK8266chltr接种的试验马血浆RNA载量为每毫升血浆10~4到10~5拷贝，比vOK8266和EIAV-DLA接种的试验马在同时期的血浆RNA载量要高，后两者的RNA载量一般低于10~4拷贝。结果表明EIAV-L的LTR比EIAV-DLA在体内有更高的启动子活性。然而，并没有发现PBMC前病毒DNA载量有类似的差异。攻毒后，与未发病马相比，发病马血浆在发热期含有高得多的病毒RNA载量(高于每毫升10~6拷贝)，而在发热间歇期，病毒RNA载量也高于每毫升血浆10~5拷贝。结果表明高水平的病毒复制可促进疾病进展。攻毒3个月后，多数未发病马检测不到血浆病毒RNA，表明在这些未发病马体内病毒复制受到抑制。然而，攻毒前后的任何采样时期，在发病马和未发病马体内都能检测到前病毒DNA。体内前病毒DNA的持续存在对EIAV持续感染的作用有待于进一步研究。3、抗体反应为了评价感染动物对疫苗毒和强毒的免疫反应，攻毒前后，利用ELISA方法定期检测所有试验马针对病毒gp45、p15、p26、p11和p9的特异性抗体。免疫后，4#和5#体内的抗gp45、p15和p26的抗体早于或高于其它试验马，可能是由于vOK8266chltr在马体内的复制水平高于vok8266和EIAV-DLA。攻毒后，发病的1#和7#体内抗gp45，p15和p26的抗体很快达到峰值并一直维持在高水平，而2#在大多数抗体产生前死亡。与之不同的是，除6#外，其余未发病马体内抗gp45，p15，p26，p11和p9的抗体水平在攻毒后一直不高。攻毒前后，未发病的6#与发病的7#有着相似的抗体水平，这可能是由于它们都接种vOK8266并都用EIAV-L攻击所致。以上结果表明，高的抗体水平与试验马的保护之间没有必然联系。p11和p9抗体只有在攻毒后的发病马体内能被检测到，提示这两种抗体的产生可能预示着EIA的疾病进展。4、体内和体外前病毒gp90的变异趋势病毒gp90和LTR是EIAV基因组变异最大的区域，两者对病毒致病性都起着重要作用。了解这两个基因的变异趋势对研究EIAV控制策略是至关重要的。攻毒前后从定期采集自1#，4#(或5#)，7#和8#的白细胞样品中提取总DNA，巢式PCR扩增包含前病毒gp90基因高变区2(V2)到高变区5(V5)的片段。对免疫期获得的序列进行比较分析，结果表明EIAV-DLA的gp90是一个准种，而在EIAV-DLA接种马体后它会变为一个更为复杂的准种。在8#体内，EIAV-DLA序列有向EIAV-L突变的趋势，提示我们可能存在EIAV-DLA毒力返强的危险。免疫了vOK8266和vOK8266chltr的试验马体内病毒gp90也有类似的变化。所有试验马用EIAV-L攻击后，只有EIAV-L的序列被克隆到。发病马体内病毒gp90发生了高度的序列变异，且变异比较集中于V3区，而未发病马体内的gp90只有中等程度的变异。新的发热期伴随着新gp90准种的出现，新准种带有大量的PND变异，提示PND的突变可能对病毒逃避宿主免疫系统的监视起重要作用，免疫逃避可以造成EIAV持续性感染和促进疾病进展。病毒gp90序列的ds／dn值表明机体对病毒的免疫选择压力在发病马的慢性感染期是强阳性的，但是未发病马的免疫选择压力一直较弱。此外，只有在未发病马体内获得了大量gp90缺陷突变体，这可能是使病毒复制水平降低而使感染马存活的原因之一。突变产生的终止密码子多数位于V4区的缺陷“热点”。5、体内和体外前病毒LTR的变异趋势分别从感染EIAV-DA或EIAV-DLA的体外培养驴MDM、感染EIAV-L的马PBMC、定期采集的试验马1#，4#和8#的PBMC等样品中半巢式PCR扩增前病毒LTR。从EIAV-L、EIAV-DA和EIAV-DLA中分别获得11、10和14个LTR序列，比较结果表明LTR-L和LTR-DA都为单一序列，而LTR-DLA则是一个由不同序列构成的准种，提示我们病毒在体外传代弱化的过程是LTR-DLA复杂准种形成的主要原因。在LTR-DLA的U3和R区分别定义了两个高变区。有意思的是LTR-DLA准种接种8#后，LTR-DLA12被迅速选择为优势序列并且此后高度保守。从1#和4#获得的序列也表明LTR在病毒的体内感染过程中是高度保守的。6、不同EIAV毒株LTR的启动子活性研究为了阐明LTR-DLA的高变区A和B的突变对LTR功能的影响，分别从EIAV-L、EIAV-DA和EIAV-DLA中选择1个或2个具有代表性的LTR序列，构建pLTR／CAT系列质粒。通过EIAV-L的LTR R区替换EIAV-DLA的R区获得了2个嵌合pLTR／CAT质粒。在加或不加EIAV-L Tat表达质粒的情况下，pLTR／CAT质粒转染马单核巨噬细胞。结果表明，在体外培养细胞中，所有LTR的基础转录活性都很低，并且它们之间的差异不显著。在共转染Tat表达质粒时，LTR-DLA较EIAV-L和EIAV-DA有更高的LTR启动子增强活性。强弱毒LTR的嵌合体pLTR／CAT质粒的转染结果表明，强弱毒LTR之间启动子活性差异主要是由R区的序列差异造成的，与U3区序列关系不大。特别是LTR TAR起始位置从强毒到弱毒的突变(A到G)改变了TAR的二级结构，这可能会影响Tat与TAR的相互作用。此外，在U3-R交界处发生的核苷酸变异可能会对病毒RNA的合成产生影响。