酶是一种生物催化剂,在生物体内高效专一的催化各种生化反应过程。在大多数生命活动中,如生物合成和新陈代谢中,酶促反应都起着至关重要的作用。详细的理解和洞察酶的催化机制是生物学上非常重要的、具有挑战性的课题,并且对于人们了解生命活动的规律和进一步指导新药物设计、基因突变效应分析以及新催化剂的设计等方面有重要的意义。实验上,借助于X-ray结晶技术和NMR光谱可揭示酶在原子水平的结构并猜测酶的催化机制,同时通过动力学和同位素标记实验确定酶催化反应过程的一些性质。尽管如此,实验技术很难捕捉到酶催化过程中的“瞬时”物种,如过渡态和反应中间体,而这些物种对于理解酶的催化机制是至关重要的。因此,对于一些酶的结构与其催化能力的相关性,以及辨别在同一催化反应里不同反应机理的可行性仍然是悬而未决的问题。近年来计算机模拟方法获得了迅速的发展,用此方法能够解释、弥补和扩展实验获得的结果。从实验信息出发,利用计算模拟可以在原子水平上详细的洞察酶的催化过程、评估不同的催化机理以及模拟过渡态和反应中间体。当前,计算模拟方法中的量子化学方法(QM,Quantum Mechanics)已经成为理解酶催化机制的重要工具。本文利用量子化学计算方法中B3LYP密度泛函方法深入的研究了羟氰裂解酶(HNL, Hydroxynitrile)、异黄酮氧甲基转移酶(IOMT, Isoflavone O-methyltrans- ferase)和查耳酮氧甲基转移酶(ChOMT,Chalcone O-methyltransferase)的催化反应机制。1.羟氰裂解酶催化机制的理论研究羟氰裂解酶对于几类生氰植物在生氰作用过程中生氰糖苷的分解以及幼苗生长过程中生氰糖苷的新陈代谢起着重要的作用。羟氰裂解酶催化氰醇断裂为氢氰酸和相应的醛或者酮。释放的氢氰酸不仅在植物系统防御食草动物和微生物攻击中担当重要的角色,而且也可以作为合成L-天冬氨酸的氮源。此外,利用羟氰裂解酶的可逆反应可以对映有则的合成手性羟氰,这类化合物是精制化学药品,医药品及农用化学品合成重要的中间体。因此,在过去的几年里,羟氰裂解酶作为一类重要的酶和生物催化剂已经引起了很多生物学家和化学家的关注。本文利用B3LYP密度泛函研究了羟氰裂解酶催化丙酮合氰化氢断裂为氢氰酸和丙酮的反应机理。根据实验的晶体结构,我们构建了两个活性位点模型A和B,分别由105和155个原子组成。这两个模型得到了相同的三步反应机理: (1) His235去质子化Ser80,同时Ser80抽取底物的羟基质子,这是一个双质子转移过程;(2)接着,底物丙酮合氰化氢的C-C键发生断裂;(3)最后,His235质子化C-C键断裂生成的氰化物。其中,C-C键断裂为限速反应步骤。在考虑环境效应的情况下,利用A模型计算第二步反应能垒为13.5kcal/mol ,B模型为14.9 kcal/mol,可以看到计算值都与利用经典过渡态理论从相应的实验速率常数推得的反应能垒值(16.1 kcal/mol)符合的很好。当前的计算结果支持了猜测的酸碱催化机理,其中催化三联体作为广义酸碱。模型C,即从A模型中移除带正电荷的Lys236,其计算结果表明:带正电荷的Lys236在降低限速反应的能垒方面有着重要的作用,并且通过与CN-形成氢键而稳定了带的负电荷CN- ,这与实验分析一致。2.异黄酮氧甲基转移酶催化机制的理论研究植物氧甲基转移酶(OMTs)组成了一个庞大的酶家族,这个家族的成员主要催化甲基化植物体中大量次级代谢产物的氧原子,主要包括苯丙素,黄酮,生物碱等。植物体中,氧甲基化在木质素生物合成,抗逆性和抗病性过程中有至关重要的作用。异黄酮氧甲基转移酶(IOMT, IsoflavoneO-methyltransferase),是植物在二级代谢过程中涉及到的依赖于S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM, S-adenosyl-L-methionine)的植物天然产物氧甲基转移酶,并且在抗微生物的紫檀碱类植物抗毒素美迪紫檀素合成中起关键作用。紫檀碱类植物抗毒素美迪紫檀素是紫花苜蓿中疾病抗性反应的重要成分。在生物体内,IOMT催化SAM的甲基转移到异黄酮黄豆苷原B环的4′-羟基上,生成S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH,S-adenosy-L-homocysteine)和芒柄花黄素,其中芒柄花黄素是合成苯丙烷类化合物异黄酮分支途径中美迪紫檀素的关键中间体。然而,在生物体外,异黄酮黄豆苷原A环上的7-羟基更容易被甲基化,从而生成异芒柄花黄素,这类化合物很少在植物体内发现并且目前也不知道其生理功能。本章利用B3LYP密度泛函方法研究了IOMT催化甲基转移反应机理并通过构建不同尺寸模型定性的描述了活性位点周围一些残基的作用。计算表明:当底物进入活性中心与酶形成复合物的同时,黄豆苷原的7-羟基质子自发无能垒的转移到His257。对于这个自发过程的可能性,我们通过在有和没有Glu318两种情况下,His257咪唑环上Nε的pKa值的计算进行了证实。随后,底物7羟基苯酚盐阴离子作为一个强亲核试剂从SAM上抽取带正电荷的甲基基团,这是一个SN2类型的反应。考虑溶剂效应情况下,基于Model F计算甲基转移的反应能垒为17.0 kcal/mol,与实验值(19.8 kcal/mol)符合的很好,反应放热12.8 kcal/mol。不同尺寸模型限速能垒的计算值表明,Glu318和Asp288在降低反应能垒上起着重要的作用,而Asn258、Asn310、Met168和Met311更多地是起到对底物空间位置和方向上的限制。此外,我们发现Glu318很可能是通过与His257之间形成静电相互作用而发挥其在催化反应中的功能,而不是实验上猜测的利用电荷转移机制。3.查耳酮氧甲基转移酶催化甲基转移机理的密度泛函方法研究紫苜蓿植物中发现的查耳酮氧甲基转移酶(ChOMT,Chalcone O-methyl- transferase)也是一种植物氧甲基酶,其主要催化S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM,S-adenosyl-L-methionine)的甲基转移到异甘草素的2′-羟基上,生成S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH,S-adenosy-L-homocysteine)和4,4’-二羟基-2’-甲氧基查耳酮。4,4’-二羟基-2’-甲氧基查耳酮是土壤根瘤菌强有力的根瘤基因诱导剂,并且也是从苜蓿根释放出的众多化合物中最有效的根瘤基因的转录调控因子。查耳酮氧甲基转移酶也能够通过调节异甘草素的甲基化来阻止查耳酮异构酶催化异甘草素环化生成黄烷酮甘草黄素,从而抑制了黄烷酮转化为大量结构上多样化的天然产物,如花青素,黄酮醇,紫檀碱,黄酮和异黄酮等。本章利用B3LYP密度泛函方法研究了查耳酮氧甲基转移酶催化甲基转移的反应机制。基于X-ray晶体结构中底物异甘草素的两种不同构型,构建了两个计算模型(模型Ⅰ和Ⅱ),给出了详细的反应机制。计算表明:两个模型中ChOMT催化的氧甲基化反应都是通过两步完成的,第一步是水介导的去质子化过程,即底物2’-羟基质子通过一个水桥,转移到His278;第二步反应是甲基通过SN2反应机制从SAM转移到新生成的底物苯酚盐阴离子上。整个催化反应的限速步骤是甲基转移过程,考虑溶剂效应情况下,构象A和B限速反应能垒分别为19.6和21.0 kcal/mol,二者都与实验值(19.8 kcal/mol)符合的很好。由于构象A限速能垒低于构象B,因而构象A动力学上更有利于催化反应,而如果考虑到构象B有更大的放热性,那么构象B对反应的贡献也是不可以忽略的。