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青贮是制备反刍动物饲料的重要方法,乳酸菌是青贮工艺的核心,是影响青贮饲料品质的决定因素。筛选区域适应性乳酸菌,定向、高效、安全地改造乳酸菌是当前青贮研究的重要方向。纤维素转化率低使得青贮饲料利用效率低,导致养殖成本增加。漆酶参与木质素降解,提高纤维素转化率。通过基因工程的方法构建能够分泌漆酶的乳酸菌,是提高饲料利用效率的有效手段。本文按照乳酸乳球菌NZ9000密码子偏好性,优化含有Usp45信号肽的枯草芽孢杆菌CotA漆酶基因序列(S-CotA),在大肠杆菌中验证优化后CotA漆酶表达活性,并将S-CotA漆酶基因与pMG36e载体连接,电转入乳酸乳球菌NZ9000,构建出具有分泌漆酶能力的重组乳酸乳球菌。优化重组菌株培养条件,表征漆酶酶学性质,考察重组乳酸乳球菌对青贮玉米秸秆品质影响。主要结果如下:1.CotA漆酶基因与pET-30a(+)表达载体连接后转化入E.coli Transetta(DE3)中。SDS-PAGE和Western Blot分析结果表明CotA漆酶能够在大肠杆菌中表达。重组菌胞内漆酶活力最高达到443.5U/L。2.S-CotA漆酶基因与乳酸菌表达载体pMG36e连接后电转入乳酸乳球菌NZ9000,Western Blot分析结果表明重组乳酸乳球菌能够分泌表达CotA漆酶。16℃培养20 h时,胞外酶活力最高达到69.6 U/L。3.CotA漆酶最适催化温度为70℃,最适pH为4;温度为20℃~60℃范围内放置2 h,相对酶活仍保持70%以上;pH为4~10范围内放置24 h,酶活仍能达到55%以上。4.室温条件下,重组乳酸乳球菌青贮玉米秸秆45 d后,乳酸、甲酸及乙酸生成量分别为106.17、52.70及24.10 mg/g,pH值为3.96,青贮效果优于对照组,且未检测到丙酸和丁酸含量。傅里叶红外光谱结果证实重组乳酸乳球菌能够修饰、改变青贮玉米秸秆木质素基团;相比于对照组,重组乳酸乳球菌青贮玉米秸秆纤维素酶解还原糖得率提高了19%。论文成功构建出能够分泌CotA漆酶的重组乳酸乳球菌,该菌胞外漆酶产量较高,可提高青贮效率,改善青贮玉米秸秆品质,是一株具有潜在应用前景的青贮乳酸菌。