镉(Cadmium,Cd)是一种有毒的重金属元素,可以造成人和动物多种器官或系统的毒性损伤。肝脏和肾脏是机体镉中毒最主要的两个靶器官。高浓度或者急性镉中毒主要引起肝损伤;低浓度或慢性镉中毒则主要造成肾损害。细胞水平上,镉可以通过多种途径诱导细胞凋亡。其中,镉诱导的细胞ROS增加是引起细胞凋亡的重要原因之一。镉能直接或间接引起细胞ROS过量产生,同时镉持续消耗MT、GSH、SOD等细胞重要的抗氧化蛋白、酶,最终造成ROS在细胞内短暂或持续性的累积。随后细胞发生脂质过氧化物反应,经历氧化损伤。氧化损伤进一步导致细胞结构完整性下降、线粒体等细胞器功能损害、染色体断裂、功能蛋白失活等一系列后果,最终细胞发生不可恢复性损伤,走向凋亡。锌(Zinc,Zn)是一种机体必需的微量元素,参与人体超过120多种酶的生物合成和300多种酶的功能调控。缺锌会造成胎儿发育异常、免疫力下降、神经紊乱、机体疾病发生和死亡率提高等一系列后果。近年来,人们发现锌可以对抗包括重金属在内多种刺激引起的细胞毒性,起到解毒效果。锌对细胞的保护作用涉及多种机制,其中,被广泛研究的一种是锌对细胞抗氧化能力的提高作用。锌通过促进细胞内还原性蛋白和抗氧化酶的表达,提高细胞的抗氧化能力,加速细胞对ROS的清除效率,对抗刺激源引起的细胞脂质过氧化物反应和氧化性损伤,最终抑制细胞凋亡。金属硫蛋白(MT)是一类富含半胱氨酸的低分子多肽,对维护细胞正常氧化还原状态起着至关重要的作用。MT对细胞自由基具有强大的清除能力,能及时清理细胞新陈代谢过程中产生的ROS。锌是MT生理状态下结合的主要金属元素,同时也是MT细胞表达的重要诱导物。锌对MT的调控依赖金属结合原件(MTF-1)的参与。锌通过与MTF-1结合,激活MTF-1蛋白活性。活化的MTF-1向细胞核移动,与位于MT转录基因上游的金属反应应答原件(MRE)识别并结合,开启MT基因转录程序。20世纪60年代起,人们陆续建立了鼠、兔、猪、猴、鱼等多种镉中毒模型,从不同角度研究镉中毒机理。近年来,有人通过向镉中毒模型中添加锌剂的方法,研究锌对镉中毒的解毒效果和作用机理。然而,作为一种外源性物质,不同剂量的锌添加会对机体和细胞产生不同的作用效果,而且不同的种属和器官对锌的耐受力也存在着很大的差异。所以锌在镉中毒过程中的作用尚不完全清楚,且备受争议。本试验在参考前人研究成果基础上,运用金属组学方法,通过以下几个方面对镉中毒以及锌对镉中毒的作用机理展开研究。1.慢性镉中毒对小鼠肝、肾中MT基因、蛋白表达的影响连续21天对昆明小鼠腹腔注射1 mg/kg体重的Cd Cl2(Cd2+计)。第22天时一次性牺牲小鼠,摘取小鼠肝、肾。提取各组小鼠肝、肾的RNA和蛋白,荧光定量PCR和双抗夹心ELISA法分别检测肝、肾MT基因和蛋白的表达水平。结果显示,与对照组相比,镉攻毒组小鼠肝脏MT-1和MT-2 m RNA转录水平均显著提高(P<0.01),分别上升7.7和10倍。镉攻毒同时引起小鼠肾脏MT基因表达量的显著增加。但与肝脏不同,镉攻毒组小鼠肾脏MT-1 m RNA的转录水平(P<0.01)高于MT-2 m RNA(P<0.05),表达量约为MT-2 m RNA的2倍。免疫组化结果显示,MT蛋白在肝细胞胞质中均匀分布,在肾脏近曲小管和部分远曲小管细胞质中存在明显。双抗夹心ELISA法进一步检测肝、肾中MT蛋白含量。对比正常组小鼠,镉攻毒组小鼠肝脏中MT蛋白含量增加,差异极显著(P<0.01);而肾脏MT蛋白攻毒前后水平趋于稳定,差异不显著(P>0.05)。这一结果可能与Cd-MT在肾脏的分解和代谢平衡有关。但无论试验组或对照组,肾脏中MT蛋白总量均高于肝脏。2.慢性镉中毒对小鼠肝、肾中金属元素代谢的影响与对照组小鼠相比,镉攻毒组小鼠肝、肾组织中镉离子含量均大幅增加(P<0.01),且镉离子在肝脏中的积累是肾脏的2倍多。伴随着镉离子在小鼠器官中的聚集,试验组小鼠肝、肾中锌离子含量也明显增加,分别达到66.04μg/g(P<0.01)和35.33μg/g(P<0.05)。与锌离子的变化趋势相反,试验组小鼠肾脏钙离子含量显著上升(P<0.01),达到700μg/g体重,而在肝脏中钙离子含量出现明显降低。铁离子变化趋势与钙离子相同,在试验组小鼠肾脏中含量显著增加(P<0.01),而在肝脏中有所降低。慢性镉攻毒后,铜离子含量在肝脏中显著增加(P<0.01);在肾脏中也有上升,但差异不显著。3.镉对牛肾上皮细胞的毒性损伤前期试验结果表明镉中毒能引起肝、肾组织对锌离子吸收的增加。为了进一步探讨镉毒性损伤以及锌在镉中毒过程中发挥的作用,本试验采用体外研究模式,对牛肾上皮细胞系(MDBK)进行镉攻毒,观察24 h内镉对MDBK细胞的毒性损伤,并通过向细胞培养液中添加Zn Cl2的方式,探讨锌添加对镉细胞毒性的作用效果及其原理。试验结果显示,单独镉攻毒造成MDBK细胞时间-浓度依赖性细胞凋亡。镉攻毒导致细胞结构破坏、骨架蛋白降解、细胞ROS含量聚集、线粒体膜电位下降等一系列毒性损伤。10μM镉处理引起细胞轻度损伤,细胞ROS随攻毒时间的延长持续积累,线粒体膜电位不断下降,部分细胞发生凋亡。50μM镉攻毒造成ROS在短时间内在细胞内的快速累积,线粒体损伤严重,大部分细胞经历不可恢复性损伤,细胞凋亡率大幅增加。4.锌添加对镉致牛肾上皮细胞毒性的影响试验向镉攻毒细胞培养液中加入不同浓度Zn Cl2,研究锌对镉细胞毒性的作用效果。结果表明,锌添加能显著降低镉中毒引起的细胞凋亡,对细胞产生明显的保护作用。试验同时发现锌对镉中毒的抑制作用是有条件的。轻度镉中毒(10μM)下,锌添加能显著降低镉中毒导致的细胞ROS过量产生,恢复线粒体膜电位水平以及细胞结构完整性,从而减少细胞凋亡,对抗镉毒性。锌添加对轻度镉中毒的抑制作用呈现浓度依赖性。提高细胞液锌离子添加量(50μM)能显著增强锌对细胞的保护作用,对镉毒性的对抗作用更明显。然而,锌的浓度依赖性细胞保护作用只在轻度镉中毒情况下效果明显,对重度镉中毒造成的损伤抑制作用并不显著。细胞遭受高浓度镉攻毒后(50μM),锌添加只能减小镉攻毒前期(<12 h)引起的细胞损伤,在一定程度上降低细胞ROS的产生,恢复线粒体膜电位水平。在重度镉攻毒后期(>12 h),锌添加对镉损伤的抑制作用不明显,甚至起到加剧镉细胞毒性的作用。这可能是因为长时间的高浓度镉攻毒导致细胞发生不可恢复性损伤,添加锌不但无法改善细胞功能或相关蛋白的活性,相反会成为额外刺激,引起细胞的二次损伤。5.镉、锌单独或联合处理对牛肾上皮细胞MTF-1、MT表达水平的影响镉、锌单独处理MDBK细胞0-24 h,MT-1/2 m RNA转录水平均呈现不同程度的上升。向镉攻毒细胞液中添加锌,MT-1和MT-2基因的表达水平进一步提高。这提示镉或锌都能促进MDBK细胞MT基因的表达,而锌添加可以通过进一步提高镉攻毒细胞中MT基因的表达量来发挥作用。另外,单独镉、锌处理均能引起MDBK细胞MTF-1基因不同程度的表达增加;向镉攻毒细胞液中添加锌,MTF-1基因的表达水平出现进一步的上升,这提示锌对MT基因的调控可能与MTF-1表达量的增加有关。蛋白免疫印迹分析表明,单独镉、锌处理均能引起MDBK细胞MTF-1、MT蛋白时间-浓度依赖性表达增强。对镉攻毒细胞进行锌补充,细胞MTF-1、MT蛋白合成量继续上升,且这种趋势也具有时间-浓度依赖性。蛋白分析结果与基因检测结果趋势相吻合。试验还通过对MTF-1、MT蛋白进行免疫荧光检测,从蛋白细胞分布强度上验证了以上结果。6.锌添加对镉攻毒细胞Cd2+、Zn2+吸收作用的影响试验采用电感耦合等离子质谱法(ICP-MS)测定镉、锌单独或联合处理过程中细胞内Cd2+和Zn2+的含量,研究锌添加是否能影响细胞对镉的吸收。结果显示,锌对低浓度镉(10μM)引起的细胞内Cd2+聚集具有显著的浓度依赖性抑制作用,且这一过程伴随着细胞内Zn2+含量的增加。而面对高浓度镉(50μM)攻毒,锌对细胞Cd2+吸收的抑制作用并不明显,甚至高剂量锌添加(50μM)会加重Cd2+在细胞内的沉积。以上结果表明,锌可以阻止镉攻毒过程中细胞对Cd2+的吸收,产生细胞保护作用。但锌这一影响的实现是有条件的,即锌对细胞Cd2+的吸收抑制在轻度镉攻毒模式下效果显著,在重度镉中毒过程中并不明显。