论文部分内容阅读
鸡传染性支气管炎病毒（infectiousbronchitisvirus,IBV）具有广泛的组织嗜性和高度变异性,不仅可以引起呼吸道症状,而且能够造成间质性肾炎和生殖系统功能障碍。我国是家禽养殖和消费大国,近几年传染性支气管炎（infectious bronchitisvirus,IB）在我国的流行情况多样且复杂,防控形势依然严峻。本研究收集了 2018年到2021年间我国部分省份养殖场疑似感染IB的临床样品,进行了病毒分离、鉴定和分析,为我国IB的防控提供新的流行病学数据支撑。此外,以原核表达的IBV N蛋白作为检测抗原,建立了检测IBV抗体终点滴度（end-point titer,ET）的 ELISA 方法,旨在降低养殖场监测鸡群抗体的成本。1.2018～2021年我国部分地区鸡传染性支气管炎病毒分子流行病学调查自2018年到2021年收集了来自江苏、安徽、河北、山东、吉林、辽宁、浙江、河南、广西、宁夏等地鸡群中发生IB鸡只的组织及拭子样品,通过RT-qPCR、病毒分离、RT-PCR、S1基因克隆、测序以及S1基因序列分析,对近4年来我国部分地区进行了 IBV的监测和基于S1基因的分子流行病学研究。从临床样品中共分离鉴定到102份IBV毒株,基于S1基因的遗传进化分析显示,有69株IBV属为GI-19（QX）型,占毒株总数的68.27%,依然是优势基因型。9株IBV属于GVI-1（TC07-2）型,占比8.65%。有3株IBV属于GI-13（7/93B 或 4/91）型 IBV,占比 2.94%。4 株 IBV 属于 LDT3-A 型,占比 3.92%。共有5株IBV属于GI-1（Mass）型IBV,占比4.90%。疫苗株有21株,占毒株总数的20.59%,其中QX型疫苗株11株、Mass型疫苗5株、LDT3-A型疫苗3株以及4/91型疫苗2株。其余的12株IBV占比为11.76%,暂时未被归为已知基因型。所有毒株的核苷酸和氨基酸同源性分别为64%～99.9%和57.9%～100%,S1序列长度范围为1611～1638 bp（537～546aa）,其中1620 bp的长度最为常见,占比70.87%。共鉴定出 7 种裂解位点序列:HRRRR（65,62.5%）、RR（S/F/L）RR（17,16.50%）、HRRKR（11,10.68%）、HRHRR（10,9.71%）和 HRFRR（1,0.98%）。在所有毒株中均预测到了 N糖基化位点且具有明显的型特异性,仅有两株毒株有O糖基化位点。对未定型毒株进行的溯源结果显示,其中的7株IBV检测到了重组事件及潜在亲本毒株,5株IBV检索到了与其同源性最高的相似毒株,暂时未将以上12株分离株归为已知的IBV基因型。2.检测鸡传染性支气管炎病毒抗体ELISA方法的建立与应用通过原核表达制备的N蛋白作为检测抗原,制备了阴性和阳性血清,不断优化试验条件,确定了 ELISA操作流程,利用阴性-阳性阈值（PNT）基线建立了 1:500稀释倍数下的校正吸光度（S/P）与IBV抗体终点滴度的线性回归方程:log（ET）=1.222×log（S/P）+3.286（P＜0.0001）,相关系数（R2）达到 0.9593,该方程可以很好预测血清样品的终点滴度。该方法重复性好,批内和批间的重复性变异系数低于10%,特异性良好与常见病原血清无交叉反应,通过试剂盒的储存条件进行优化和筛选,研制rIBVN—ELISA试剂盒可在4℃和-20℃条件下保存半年之久。对本方法的测试效果进行验证和评估,使用本课题建立的rIBVN—ELISA方法和商品化试剂盒同步检测在规模化养殖场两栋鸡舍采集的461份血清样品。与商品化试剂盒相比,本方法总体阴、阳性符合率为93.06%,抗体滴度的消涨趋势高度吻合,不同日龄的血清检测的变异系数接近,抗体滴度分布情况较为一致,ROC曲线分析显示,建立的ELISA方法敏感性达到99.75%,特异性达到100%（P＜0.0001）。经验证,rIBVN—ELISA方法具有良好的检测效果,能够应用于养殖场疫苗免疫效果评估以及野毒监测。