目的：　　螺旋藻(Spirulina)是一类进化历史悠久、含叶绿素a（但不形成叶绿体）、能进行产氧性光合作用的大型原核生物。其抗逆性强，在热泉、盐水湖及其他恶劣环境中，是唯一或主要的光养生物;螺旋藻已被广泛应用于基础研究，如光合作用、细胞分化与氮的固定、碳源与氮源的利用、抗环境胁迫以及分子进化等领域。本课题通过研究螺旋藻耐盐碱基因启动子的结构及与调控基因功能的关系，揭示螺旋藻耐盐碱的分子机理。鉴定螺旋藻抗逆相关基因，可为植物基因工程育种提供新的功能基因，也为培育抗逆性增强的螺旋藻新品种、挖掘其他藻类抗逆功能相关基因奠定基础，具有重要的科学意义，将产生一定的社会效益。　　方法：　　1设计引物，提取螺旋藻总DNA，通过PCR方法扩增钝顶螺旋藻RuBisCO基因5端上游启动子区域199bp的片段(pro);设计扩增绿色荧光蛋白(GFP)基因引物，以携带GFP基因的质粒为模1板扩增GFP基因;以RuBisCO基因启动子区域片段和绿色荧光蛋白基因（gfp）片段为模板，通过重组PCR技术，得到含启动子区域和GFP基因的DNA片段。　　2重组PCR产物与pMD18-T载体相连接。连接产物转化入感受态大肠杆菌JM109。限制性核酸内切酶酶切鉴定重组克隆片段，最后测序验证目的基因。　　3检测不同盐浓度下pMD18-pro∷g/E.coli JM109转化子的荧光强度。　　4利用生物信息学方法对这一启动子区域中可能存在的转录起始位点进行预测，使用步移缺失设计引物以获得10段长度不等的pro-gfp片段，再克隆入pMD18-T载体并导入感受态大肠杆菌JM109。　　5培养并观察各突变个体中的绿色荧光蛋白表达情况。　　6定点突变分析-35区六核苷酸(TTGACT)的精确位置。　　结果：　　1螺旋藻耐盐相关基因启动子PCR产物的片段大小为199bp，GFP基因PCR产物的片段大小为717bp，重组PCR的片段大小为916bp，与预期的结果吻合。　　2重组PCR产物和pMD-18T载体成功连接，并成功转化入感受态大肠杆菌JM109，经双酶切鉴定和测序鉴定，序列正确无误。　　3实验结果显示LB液体培养基含0.2M、0.4M、0.6M和0.8M NaCl条件下，pMD18-pro∷gfp/E.coli JM109转化子GFP的荧光水平均高于正常培养条件对照组(0.02M NaCl)，表明该启动子可以被高浓度的盐所诱导。　　4 PCR扩增得到了上述重组产物的10条步移缺失片段，成功构建10个缺失突变表达质粒并转化入感受态大肠杆菌JM109。　　5突变体1-9均能发出绿色荧光，而突变体10不能发光。综合上述实验结果可推测出钝顶螺旋藻耐盐相关基因RuBisCO基因的核心启动子区为第二种预测结果，即位于-94～-54bp之间，同时该区域内的TTGACT与TATTTT序列分别相当于原核生物核心启动子区的-35区与-10区。　　6定点突变分析表明，当-35区TTGACT第六个核苷酸(T)改为A，启动子的活性保持不变。然而，当第一T或第二T被突变后，启动子的活性急剧下降;当-35区TTGACT与-10区TATTTT被插入或者删除四个碱基，启动子的活性急剧下降。　　结论：　　钝顶螺旋藻耐盐相关基因RuBisCO基因的核心启动子区位于-94～-54bp之间，同时该区域内的TTGACT与TATTTT序列分别相当于原核生物核心启动子区的-35区与-10区，且这两个区之间、以及TATTTT与转录起始位点之间相隔的位置均为最佳距离。当-35区TTGACT与-10区TATTTT被插入或者删除四个碱基，启动子的活性急剧下降;当-35区TTGACT的第一T或第二T被点突变，启动子的活性急剧下降;当第六个T被点突变成A，启动子的活性保持不变。软件预测还表明这199bp的启动子区域内的存在几种基因表达相关的调控元件，如GATA盒、MYB1 AT和MYCCONSENSU SAT等。确定启动子结构和功能，将有助于阐明基因表达调控的分子机制。