禽流感(Avian influenza,AI)是由A型流感病毒引起的一种感染性疾病,禽类是其主要易感宿主之一。高致病性H5N1亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)因其对养殖业的危害以及跨越种间障碍感染人类或者大流行,对公共卫生安全造成严重威胁而广受关注。AIV感染是病毒与宿主相互作用的过程,不仅取决于自身的表型,而且与宿主因子有关。目前对AIV感染机制的研究多集中在病毒自身表型的差异,并且在一些关键基因和氨基酸位点的研究不断更新,也取得了重要的突破。AIV基因组包含8个节段表达11种蛋白,如此小的基因组组成,使得AIV必须利用宿主细胞的成分和机制合成自身的成分,在感染细胞内进行复制和组装并释放到细胞外,实现病毒的有效复制。另一方面,病毒侵入机体细胞后应病毒复制的需要,宿主内的某些成分发生变化,同时宿主细胞为抵御病毒入侵和复制,开启防御机制引起免疫应答反应,这必然会引起宿主细胞内特异性的变化。这种变化不仅发生在基因水平,也发生在蛋白水平,而对这些差异基因和蛋白的分析对于我们探寻新的研究靶标以及更好的理解AIV的致病性具有重要作用。由于翻译后修饰等原因,在转录水平和蛋白质水平表达存在一定的差异,因此整合转录组和蛋白质组分析可以提供更为全面的分子信息。尽管一些探索AIV感染的差异研究已经有所报道,但这些研究大部分都集中在细胞水平以及可以感染人的毒株,而对禽类感染AIV的差异研究还比较有限。脾脏作为禽类重要的免疫器官,具有启动免疫应答,清除血液内外源性物质和受损红细胞的作用,在病毒感染中发挥抗感染和免疫应答的功能。本研究利用H5N1亚型AIV感染SPF鸡,获得AIV感染鸡脾脏组织。采用双向凝胶电泳(2-DE)与电解离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF)以及鸡基因组芯片相结合的技术研究AIV感染鸡脾脏蛋白水平和转录水平的差异。结合GO等生物信息学手段对获得的差异蛋白和基因进行生物学功能鉴定并利用KEGG数据库信息检索对筛选到的差异表达基因参与的Pathway进行分析。经筛选获得的部分差异基因和蛋白,利用Western blot和实时荧光定量PCR(RT-q PCR)对其m RNA转录水平和蛋白表达水平进行进一步验证分析。主要研究结果如下:(1)H5N1亚型AIV感染组织病毒含量检测与病理学分析试验采集H5N1亚型AIV感染后24 h鸡的气管、脑、胸腺、心脏、脾脏、肝脏、肺脏、肾脏和法氏囊组织,并利用鸡胚对其组织病毒含量滴定,结果表明在以上组织内均检测到较高滴度的病毒,而PBS对照组没有检测到AIV存在。病理变化观察显示实验所使用的H5N1亚型AIV可对感染雏鸡的脑、肺脏、胸腺、脾脏、法氏囊、肾脏、心脏、肝脏和气管并引起相关的病理损伤。切片免疫学检查显示采集的脑、气管、胸腺、心脏、脾脏、肝脏、肺脏、肾脏以及法氏囊组织内均检测到AIV的NS1蛋白存在,这与组织病毒滴定结果一致,证实AIV感染试验成功。(2)H5N1亚型AIV感染鸡脾脏差异蛋白质组学分析为鉴定h5n1亚型aiv感染鸡脾脏差异表达蛋白,首次采用2-de和maldi-tof/tof技术相结合的方法对aiv感染鸡脾脏差异蛋白质组进行研究。利用t-test和差异倍数(fc)方法筛选差异表达蛋白质。通过2-de图谱分析,获得差异倍数在1.5倍以上的蛋白点,经maldi-tof/tof鉴定分析,蛋白可信度在95%以上的蛋白点33个,表达27种蛋白。利用基因本体学(go)注释显示aiv感染组与对照组差异表达蛋白可分为34个功能类别,包括氯化物代谢、免疫系统、转运、逆境胁迫、细胞周期、核糖体生物合成、小分子代谢、复制、蛋白组装、蛋白修饰、mrna过程、蛋白折叠、分解代谢、生物合成、核苷酸代谢、解剖结构形成、细胞分裂、细胞形态学、翻译、脂代谢、核质运输、细胞粘附、核糖核蛋白组装、细胞分化、生长、内稳定和大分子复合物组装。其中多数差异表达蛋白参与转运、代谢和免疫系统反应。基于分子功能分类发现这些差异表达蛋白主要是具有细胞骨架组成、酶活性以及离子结合功能的蛋白。(3)h5n1亚型aiv感染鸡脾脏转录组差异分析为研究h5n1亚型aiv感染鸡脾脏的转录组差异,我们利用affymetrix鸡基因组芯片对h5n1感染鸡脾脏进行转录组表达分析。对照组和感染组的芯片杂交背景值分别为38.93922和36.17032,检出率分别为48.93993%和45.28351%。芯片筛选阈值设置为2≤fc且至少一组不出现a或fc≤0.5且至少一组不出现a。根据设定的阈值总共获得aiv感染组与对照组差异表达有信息注释的基因2457条,其中1284个基因表现上调,1173个基因下调。go分析表明2457个差异表达的基因基于生物学过程分类,可以归为24个类别,包括复制、细胞杀伤、免疫系统过程、代谢过程、细胞过程、解剖结构、病毒复制、死亡、再生过程、生物粘附、多细胞生物体过程、发育过程、生长、迁移、色素沉积、生物节律、刺激反应、定位、定位建立、生物体过程、生物调节、生物过程阳性调节、生物过程阴性调节和生物过程调节。通过kegg数据库检索分析差异基因产物所在的生物学通路,共发现137个信号通路。p-value显著性富集分析,35个通路的pvalue≤0.05,其中细胞粘附分子、细胞因子与细胞因子受体相互作用、ecm与受体相互作用、黏着斑通路富集的显著性居首位,其次代谢、toll样受体、过氧化物酶体增殖物激活受体以及p53信号通路都呈现较高的显著性富集。(4)差异表达基因及蛋白验证通过以上分析获得的差异成分,最终试验选择16个参与感染和免疫反应相关的差异表达基因及蛋白,利用rt-qpcr方法对其mrna水平表达进行验证。结果发现组织转谷胺酰胺酶(tgm2)和结蛋白(des)基因表达水平与蛋白表达水平趋势一致,此外actr3、ywhab、rpsa和b2m蛋白基因水平表达趋势也与2-de结果一致,而ly86表达变化呈现相反趋势。tgm2、il1、il6、ifn-γ、ifn-β、mmp1、samd3、pcsk5和il2基因表达水平与基因组芯片检测的表达趋势相同。bf2基因rt-qpcr验证结果与芯片杂交正好相反。在2-DE和基因组芯片分析中,TGM2与B2M为芯片、2-DE分析的共同差异表达基因,其RT-q PCR验证中表达趋势均与芯片和2-DE检测一致。在筛选的差异蛋白中,试验选择多个差异蛋白进行Western blot验证分析,最终成功验证了TGM2和DES 2个差异表达蛋白。这2种蛋白在感染组中表达量与对照组相比呈现上调,其表达变化趋势与2-DE结果一致。TGM2基因在芯片、2-DE、RT-q PCR验证以及Western blot验证中表达趋势一致。本研究首次进行了AIV感染鸡脾脏蛋白质组和转录组表达的完整分析,将增加我们对AI致病机制和病毒与宿主相互作用的了解,为筛选蛋白进行进一步研究和筛选抗病毒药物宿主靶标奠定基础。