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目的:研究大肠癌患者中错配修复基因MSH6外显子5、6、8及部分外显子4的基因突变情况。研究大肠癌患者机体的氧化应激状态,并探讨8-羟基脱氧鸟苷(8-OH-dG)修复基因hOGG1多态、谷胱甘肽转硫酶(GSTM1)基因及过氧化氢酶(CAT)基因多态性与大肠癌的关系。
方法:2004年7月-2005年7月在哈尔滨医科大学附属第二、第三医院的大肠癌患者经医生及患者同意,收集其外周血、肿瘤组织及癌旁组织。采用成组的病例.对照研究方法探索hOGG1,GSTM1及CAT基因多态性与大肠癌的关系;PCR-SSCP筛查MSH6基因的第5、6、7、8及部分外显子4的突变,然后测序确认。用PCR-限制性片断长度多态性(RFLP)方法检测hOGG1基因型和CAT基因型,用PCR方法检测GSTM1基因型。用成组病例对照研究从促氧化物、抗氧化酶、非酶类抗氧化剂以及氧化应激代谢产物等方面来反映机体抗氧化能力的强弱,对大肠癌患者及其对照机体的氧化应激状态进行全面系统的比较、分析、评价;氧化应激相关的各项指标测定方法为:分光光度法测定SOD、GSH-Px、CAT、GST、VitC、OH、NO、AOPP、MDA、蛋白羰基;荧光分光光度法测定GSH、VitE;原子吸收分光光度法测定Mg、Zn、Cu、Fe;紫外分光光度法测定共轭二烯;ELISA法测定8-OHdG。
结果:对214例散发大肠癌及30例家系大肠癌患者标本进行PCR-SSCP筛查,结果表明大肠癌患者血标本的外显子5突变率为1.44%(3/209);外显子6突变率为1.38%(3/218)。测序发现肿瘤组织DNA外显子5有2例第20407位碱基发生了置换突变(A→T,1例第20459位碱基发生了无意义突变(G→A);外显子6没有突变。成组病例对照研究表明:纯合子Cys/Cys基因型在病例组与对照组中差异无显著性(OR=0.62,P=0.24,P>0.05),Cys/Cys基因型与Ser/Ser基因型相比,其比值比为0.62(95%CI:0.28-1.38,P=0.24),杂合子的个体患大肠癌的危险性并不高。GSTM1无效基因型在病例组为47.83%、对照组为45.69%,差异无显著意义P>0.05)。大肠癌组与正常对照组CAT多态性突变基因型差异无统计学意义(P=0.21,P>0.05),杂合子突变基因型者并未见有大肠癌危险比增加(OR=1.01,95%CI=0.65~1.56,P>0.05)。对基因和相关产物浓度分析结果表明,hOGG1的不同基因型患者血清8-OhdG浓度分别为7.33ng/ml、16.93ng/nl,无显著差异(P>0.05)、GSTM1的不同基因型患者血清GST浓度分别为11.34 U/ml、21.66 U/ml,差异有统计学意义(P<0.05)、CAT的不同基因型患者血清CAT浓度分别为3.95U/ml、3.34 U/ml,无显著差异(P<0.05)。除hOGG1病例组之外,其它各组基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。通过对三种基因的交互作用分析结果表明:hOGG1基因与GSTM1基因没有交互作用(P=0.80,P>0.05);hOGG1基因与CAT基因没有交互作用(P=0.62,P>0.05)。GSTM1基因与CAT基因的交互作用分析表明,GSTM1基因与CAT基因有交互作用:当GSTM1为功能型时,CAT杂合子和纯合子突变性发生与无突变型相比与大肠癌关系的OR值为2.32(P<0.0383),当CAT基因无突变时,GSTM1的无效型发生大肠癌是功能型的3.82倍(P=0.0078)。GSTM1无效型且CAT突变杂合子和纯合子大肠癌发生是GSTM1功能型且CAT无突变发生的1.57倍,GSTM1与CAT有负向的交互作用(OR1=0.18,P=0.0042,<0.05)。研究发现:与正常对照人群相比,大肠癌患者体内羟自由基(OH)和一氧化氮(NO)含量明显升高(OH病例:对照值=11139.40:933.47,P=<0.01;NO病例:对照值=97.46:78.38,P=<0.01);SOD、GSH-Px、CAT、GST等酶类抗氧化剂活力减弱(SOD病例:对照值=81.28:123.22,P=<0.01;GSH-Px病例:对照=140.73:162.10,P=<0.01;CAT病例:对照=3.50:6.00,P=<0.01;GST病例:对照=8.20:12.2312,P=<0.01);维生素C、维生素E及微量元素Zn、Fe、Mg等非酶类抗氧化剂含量低(VitC病例:对照=16.03:89.64,P=<0.01;VitE病例:对照=10.60:18.50,P=<0.01;Zn病例:对照=3.17:4.49,P=<0.01;Fe病例:对照=17.85:21.30,P=<0.01,Mg病例:对照=212.92:237.15,P<0.01),而Cu含量高(病例:对照=5.37:2.86,P=<0.01;P<0.01),GSH降低(病例:对照=170.86:215.02,P<0.01);MDA、共轭二烯等脂质过氧化损伤产物明显下降(MDA病例:对照=3.05:5.81,P=<0.01;共轭二烯病例:对照=0.18:0.30,P=<0.01;P<0.01);蛋白质氧化损伤产物蛋白羰基和AOPP增多(蛋白羰基病例:对照=3.82:2.92,P=<0.01;AOPP病例:对照=32.69:26.31,P=<0.01);DNA氧化损伤产物8-OHdG明显增多(病例:对照=24.13:5.95,P<0.01)。
结论:大肠癌患者中错配修复基因MSH6的突变率很低,在外显子5和6发现有突变,经测序,外显子5有2个碱基发生了置换突变,1例碱基发生了无意义突变。hOGG1,GSTMl,CA瑾因多态性与罹患大肠癌没有显著相关,但是,GSTM1无效型基因的CRC患者血清中GST浓度明显降低。并且hOGG1与GSTM1、hOGG1与CAT基因的交互作用与大肠癌发病无显著相关,GSTM1与CAT有负向的交互作用。大肠癌患者体内氧化还原状态发生了改变,存在严重的氧化应激,伴随着癌症的发生与发展,氧化损伤程度也在不断加剧。深入研究氧化应激与大肠癌的关系,对大肠癌的预防与治疗具有重要意义。