siRNA沉默HIF-1α对缺氧培养的人脉络膜黑色素瘤细胞EPO表达的影响

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目的:采用阳离子脂质体介导的转染方法,以RNA干扰为手段,研究HIF-1α-siRNA对缺氧培养的人眼脉络膜黑色素瘤细胞(OCM-1)转染前后缺氧条件下HIF-1α和EPO的表达,初步探讨HIF-1α在缺氧条件下对人眼脉络膜黑色素瘤的调控作用。方法:正常组OCM-1细胞采用含10%胎牛血清、1%双抗(青-链霉素混合液)的DMEM高糖培养基培养,将细胞置37℃、5%CO2细胞培养箱内培养,取处于对数期生长的细胞用于实验研究。缺氧组OCM-1细胞在原培养基中加入COCl2至浓度为100μmol/L用于模拟肿瘤内部乏氧微环境。并将缺氧组细胞分为单纯缺氧组、干扰组、阴性对照组、阳性对照组、脂质体对照组;设计并合成siRNA(siRNA+阴性对照+阳性对照),并在基因库进行Blast同源性分析。利用阳离子脂质体Lipofectamille2000Reagent为载体将合成的siRNA转入脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1内。RT-PCR检测OCM-1细胞HIF-1α及EPO在RNA水平上的表达情况,Western blot检测HIF-1α及EPO蛋白表达情况。结果:缺氧组各组之间相比,阳性对照组β-actin mRNA表达下降(p<0.01),证实转染成功;单纯缺氧组与常氧组相比,HIF一1α mRNA表达无明显差异(p>0.05),蛋白表达显著升高(p<0.01),而EPO mRNA和蛋白的表达均显著升高(p<0.01)。干扰组HIF-1α禾EPO mRNA和蛋白表达均明显下降(p<0.01),阴性对照组与脂质体对照组相比各检测因素均无明影差别(p>0.05)。结论:1.在缺氧状态下OCM一1细胞HIF-1αm RNA表达无明显变化,蛋白水平表达升高;EPO的mRNA和蛋白表达量均增加。2.合成的HIF-1α-siRNA通过转染OCM-1细胞后,HIF-1α mRNA和蛋白表达量均下调;EPO的mRNA和蛋白表达量也均下调。3.EPO作为HIF-1α的下游靶基因,其表达HIF-1α调控。
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