研究背景：胃癌是世界范围内四种主要的癌症之一,每年新发胃癌病例和因胃癌导致的死亡病例在所有癌症中高居前列,严重威胁着人类身体健康。2000年,全球新诊断出的胃癌病例超过87万例,病死人数超过64万人；2012年,这两个数据分别为超过95万例和72万人。全球超过60%以上的胃癌病例分布在欠发达国家,常见于中国、韩国以及其他东亚国家,在日本也有较高发生率。在中国是属于最常见的恶性肿瘤之一,死亡率较高。胃癌可由多种因素引起,胃癌的发生是一种复杂的、多因素参与调控的过程。有研究表明,幽门螺旋杆菌感染与胃癌的发生存在很大的关联。环境和饮食因素也在胃癌的发生中有着重要作用。此外,胃癌的发生还存在家族聚集倾向,提示遗传因素也是导致胃癌发生的重要因素之一。糖类抗原72-4 (Carbohydrate antigen 72-4, CA72-4)是一种重要的糖蛋白类肿瘤标志物,与早期胃癌临床诊断的相关性很高,是近些年来新发现的具有重要临床应用价值的肿瘤标志物之一,并且CA72-4抗原对胃癌大小、转移、分期以及指导胃癌预后预测也有意义。在临床实际应用中,一般常与其它标志物联合检测,能够提高胃癌诊断的敏感性、特异性和有效性。当前,检测肿瘤标志物CA72-4的方法较多,依据检测目标类型可分为基因检测和蛋白检测两类,包括实时荧光定量PCR法(Real-time fluorescence quantitativePCR, RTFQ-PCR) 、电化学发光免疫测定法(Electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA)、酶促化学发光测定法(Luminescent Enzyme immunoassay, LEIA)、放射免疫测定法(Radio Immunoassay, RIA)、侧向流层析免疫测定法(Lateral flow immunochromatographic assays)和酶联免疫吸附测定法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)等。但是,这几类检测方法均存在诸多缺陷,如PCR检测耗时较长、样品处理复杂、对操作环境和人员要求高、易发生污染、无法直接检测蛋白等；化学发光法虽然能够直接针对CA72-4抗原检测,但同样耗时较长,同时需要大型配套检测设备,成本高昂；而普通的侧向流层析试纸却因为荧光材料自身半衰期短、易漂白等缺点,无法真正实现准确定量。因此,迫切需要一种真正能够实现快速简便、定量精准、成本可控的新型检测手段。免疫层析(Immunochromatography, IC)是一种将免疫学技术和色谱层析技术相结合的快速免疫分析方法,样品中待检测的抗原或抗体通过毛细管层析泳动至检测区域,抗原和抗体发生免疫反应,从而实现特异性的检测。免疫层析检测技术的最突出优势在于对样品的一步法检测,无需分离游离的标记物,具有快速、简便、准确的优点,广泛应用于临床医学检测、毒品检测、食品安全检测、植物病原体检测、药物残留检测等领域。免疫层析技术起源于20世纪80年代,有研究报道利用该技术检测人体血浆中的C反应蛋白(C-reactive protein, CRP),通过酶促显色反应判定结果。1990年,胶体金颗粒被作为标记物首次用于对人尿和血清中的人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin, HCG)成分进行检测,开创了胶体金免疫侧向流层析技术的先河。近些年,随着新型纳米材料的制备及应用研究的发展,逐渐涌现出一系列新型标记物,如胶体碳、稀土元素、上转磷光(up-converting phosphor, UCP)、荧光微球、磁珠、乳胶颗粒和量子点等,改进和完善了传统的免疫层析检测技术,为免疫层析技术的更广泛应用奠定了基础。量子点(Quantum Dots, QDs)又称纳米晶,通常是一种由Ⅱ～Ⅵ族、Ⅲ～Ⅴ族或Ⅳ～Ⅵ族元素组成的纳米颗粒,尺寸一般不超过10 nm,具有明显的量子效应如表面效应、限域效应、隧道效应和尺寸效应等。量子点具有较宽的激发光谱和较窄的发射光谱,具有很好的荧光强度和稳定性。此外,量子点的发射光谱还随着尺寸大小和组成成分的不同而改变。这些特点使得量子点越来越成为一种重要的荧光标记物用于免疫分析技术中。量子点既可以由一种半导体材料组成,如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe等,也可以由两种或两种以上的半导体材料组成。传统上,通过三辛基膦-氧化三辛基膦(TOP-TOPO)有机相合成法制备的量子点由于其疏水性而无法直接在生物领域应用,需通过功能基团、二氧化硅等进一步修饰使其具备亲水性,进而连接上生物活性物质来实现其生物相容性。但是,这些额外的修饰过程,会导致量子点粒径的变大,同时降低荧光量子产率,限制其进一步应用。随着量子点合成技术的飞速发展,近些年,逐步涌现出了量子点制备的水相合成方法,能够制备得到带有多种功能基团的高荧光量子点,如羧基、巯基等,这为量子点在生物医学领域的广泛应用奠定了基础。研究内容和方法：本研究致力于研制一种基于新型CdSe/ZnS量子点荧光探针的胃癌血清CA72-4抗原快速定量检测试纸,以满足临床上胃癌血清标志物CA72-4抗原的快速精准定量检测要求。主要研究内容和方法包括：(1)首先,对新型水溶性CdSe/ZnS量子点进行一系列理化性质的表征和鉴定,包括电镜观察、激发光谱和发射光谱鉴定,筛选得到一种粒径约为5-7 nm的水溶性量子点纳米材料,该量子点颗粒表面带有羧基(-COOH),易与单克隆抗体偶联。该型量子点具备荧光强度强、抗漂白、无毒等优势,在365 nm激发光照射下,发出明亮的红色荧光。(2)其次,筛选针对CA72-4抗原的鼠源单克隆抗体,选择两株单抗CC49和B72.3分别作为标记和包被抗体,并对其纯度、分子量等进行鉴定。(3)接着,将筛选得到的符合要求的新型CdSe/ZnS核壳型量子点材料与针对CA72-4抗原的单克隆抗体CC49进行偶联标记,得到QDs-CC49荧光探针。对量子点偶联标记单克隆抗体的方法进行了摸索,确定了标记方法及标记条件。应用BCA蛋白定量方法测定单克隆抗体CC49残留量,计算得到标准曲线(y=0.1382x-0.0016,R=0.998),进而计算得出量子点和单克隆抗体CC49的偶联标记效率。结果显示,单克隆抗体CC49与量子点QDs的标记效率很高；利用荧光分光分度计扫描考察荧光探针和单纯量子点的激发光谱和发射光谱,发现两者具有相似的激发光谱和发射光谱,且标记后的荧光探针的发射光强度更高,提示标记后的荧光探针兼具量子点和单克隆抗体的双重特点,可以用于试纸条的开发。(4)然后,将标记好的QDs-CC49探针与CA72-4单克隆抗体B72.3分别置于玻璃纤维和硝酸纤维素膜上,制作形成量子点探针结合垫和反应膜,进而组装成为基于量子点荧光探针的CA72-4抗原快速定量检测试纸。本研究首先建立了基于量子点荧光探针的快速检测CA72-4抗原的双抗体夹心法侧向层析试纸的技术平台,其中包括配套定性和定量检测仪器的筛选和验证。然后,详细考察了该试纸条各组成成分的处理工艺和参数,尤其是单抗B72.3的包被量、包被时间、包被缓冲体系、QDs-CC49在结合垫上面的覆膜量以及该试纸条的回收率等。本研究还对该试纸条的均一性和稳定性进行了考察。(5)最后,对本研究研制的CA72-4抗原快速定量检测试纸进行了初步的性能评估,主要分为三个部分：其一,利用梯度稀释的CA72-4抗原标准品评估该试纸的分析灵敏度和特异性；其二,检测临床胃癌血清标本(11份CA72-4抗原单独阳性标本、29份多项肿瘤标志物混合阳性标本和大量阴性对照标本),对其灵敏度、特异性进行了评估；其三,通过检测100份临床血清标本(70份CA72-4抗原阳性标本和30份阴性标本),对该试纸条与市售主流试剂Roche ECL试剂的性能进行了比较。研究结果：本研究将该量子点QDs标记上糖类抗原CA72-4单克隆抗体CC49,形成量子点-抗体QDs-CC49荧光探针,最终研制成功基于新型CdSe/ZnS量子点荧光探针的快速定量检测试纸,研究和建立了试纸条所涉及的各项工艺参数和条件,并对该试纸条的灵敏度、特异性等性能进行了评估。研究结果表明,该试纸条对CA72-4抗原标准品的检测分析灵敏度可达到2 IU/mL。该试纸条对11份CA72-4抗原单独阳性的临床血清标本检测灵敏度为100%(11/11),对6份阴性血清标本的特异性为100%(6/6),而对多种肿瘤标志物混合的CA72-4抗原阳性的血清标本检测灵敏度也为100%(29/29),对10份阴性血清标本均无一检出。检测100份临床血清标本的结果显示,该试纸条与Roche电化学发光试剂的符合率为100%(100/100)。上述结果提示,该种基于新型CdSe/ZnS量子点荧光探针的CA72-4抗原快速定量检测试纸条具有良好的检测性能,并且操作极其简单,反应时长仅需5-10分钟,能够满足临床上对胃癌标志物检测的需求。