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糖苷酶（Glycosidase,EC 3.2.1）催化各种糖基化合物中糖苷键的水解,在糖生物学研究中具有重要价值。粪肠球菌和屎肠球菌是哺乳动物肠道内的主要菌群,存在活跃的糖苷代谢酶系,是糖苷酶制备的潜在微生物来源。本研究以NCBI数据库中粪肠球菌和屎肠球菌基因组数据为基础,设计引物扩增粪肠球菌内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（e ndo-beta-N-acetylglucosaminidase,ENGase/Endo,EC 3.2.1.96）endoEf、endoE与内切-α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶（又称为O-糖苷酶）（endo-alpha-N-acetylgalactosamine,Endo-GalNAcase/Ogly,EC.3.2.1.97）oglyEf基因和屎肠球菌自溶素（autolysin,Auto）auto Ef m基因。以无缝克隆的方式构建重组表达载体,在实现重组表达和纯化的基础上对上述糖苷酶的酶学性质和催化特性进行分析。结果表明:（1）endoEf基因去除N-端信号肽后长822 bp,包含273个氨基酸,预测得到其分子量为30.12 kDa,等电点为5.41。Endo Ef与商品化的褶皱链霉菌源的内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶氨基酸序列相似度高达70%,且存在保守的GH18基序DXDXE。成功构建原核表达载体pET-28a-endoEf,实现了在大肠杆菌中的高效可溶性表达,经钴离子亲和层析每升菌液可纯化202.1 mg目标蛋白,以核糖核酸酶B（ribonuclease B,RNas eB）为底物,其比活力为1.0×104 U/mg。EndoEf可以酶切天然及变性状态下的RNase B和鸡卵清蛋白（ovalbumin,Ova）,但不能水解免疫球蛋白G和转铁蛋白的复杂型糖链。MALDI-TOF-MS进一步证明了EndoEf对RNase B上N-连接糖链的水解。EndoEf最适温度为40℃,最适pH范围为5.0-7.0,可耐受1 mol/L NaCl、100 mmol/L DTT、2%SDS和2%Triton X-100。定点突变研究表明,EndoEf的129位谷氨酸是催化关键氨基酸残基。采用环氧氯丙烷活化的Sepharose CL 6B固定化EndoEf,偶联率为78.95%。固定化的EndoEf可以水解RNaseB和Ova,固定化酶在4℃存放三个月后,仍保持水解活力。（2）endoE基因全长2508 bp,oglyEf基因去除信号肽编码序列后长3891 bp,分别编码835和1296个氨基酸,EndoE预测分子量为94.06 kDa,等电点为4.96,OglyEf预测分子量为147.11 kDa,等电点为5.22。EndoE蛋白包含一个N-端GH18水解结构域和一个C-端GH20水解结构域,OglyEf蛋白具有典型的GH101结构域。分别构建表达载体pET-28a-endoE和pET-28a-oglyEf,并在大肠杆菌中得到成功表达,使用钴离子亲和层析和阴离子交换层析两步纯化获得了Endo E和Ogly Ef。EndoE不仅可以酶切天然及变性状态下的RNaseB和Ova,而且可以水解天然及变性状态下的Ig G,但是不能水解Trf。以RNaseB为底物,EndoE比活力为8.33×103 U/mg。EndoE在温度20-50℃和pH4.0-6.0的范围内,均能发挥最大水解活性,且对DTT、NaCl和Triton X-100具有很好的耐受性,但其活性受阴离子表面活性剂SDS的强烈抑制。以Galβ-1,3Gal NAc-α-PNP为底物,OglyEf比活力为2.2×106 U/mg,最佳反应温度和pH分别为50℃和5.0。OglyEf对表面活性剂SDS和Triton X-100有一定的耐受性,金属离子Ca2+对OglyEf活性有显著的促进作用。通过双倒数作图法,得到OglyEf的Km为95.2μmol/L,Vmax为153.8 mmol/mg·min。（3）autoEfm基因去除信号肽编码序列后长度为1194 bp,共包含397个氨基酸,预测得到其理论Mw和p I分别为44.00 kDa和4.82。AutoEfm与已报道的单增李斯特菌源的自溶素氨基酸序列相似度为58%,且具有保守的GH73结构域。构建重组载体p ET-28a-autoEfm,并在此基础上构建对应的N-端截短体、C-端截短体和双截短体表达载体pET-28a-autoEfmΔN、pET-28a-autoEfmΔC和pET-28a-autoEfmΔN+C,且分别在大肠杆菌BL21 Star（DE3）宿主中实现了成功表达,但经过表达条件的优化,AutoEfmΔN均以无活性的包涵体蛋白形式表达。溶菌活性分析发现,AutoEfm和AutoEfmΔC不具有活性,而AutoEfmΔN+C表现出明显抑菌活性,可以水解溶壁微球菌细胞壁,比活力为8.2×104 U/mg,该结果表明,AutoEfm的N-端可能存在抑制酶活性结构域。酶学性质分析表明,AutoEfmΔN+C最佳温度和pH分别为40℃和5.0,其活性受二价铁离子的显著抑制。