研究背景宏转录组技术是研究样本中各生命形式整体转录水平的高通量测序技术,在土壤、海洋、农业、医学和病原领域中均有广泛应用。传统的宏转录组测序技术通过完全随机的六聚体引物库（4096条六聚体引物）,能够对RNA核酸进行无偏倚地反转录和扩增,可以对样本中除真核生物编码序列外的细菌和病毒等微生物的表达和群落变化进行研究。由于细胞中绝大部分（约90%）RNA核酸为核糖体RNA（ribosomal RNA,r RNA）,往往需要额外的步骤来去除r RNA。目前市面上用于r RNA去除的试剂盒对RNA核酸初始投入量要求高,价格昂贵,文库构建时间需要增加2个小时以上,而且目标去除r RNA的物种往往限制在人、啮齿类动物和几种细菌内,对于去除其他物种的r RNA效率较低。另外,目前去除微生物r RNA的研究主要是根据已测序微生物的r RNA序列定制特异性探针,操作繁琐,价格昂贵,不适宜大规模使用。因此,研究即能高效去除微生物r RNA又具有高性价比的技术非常重要,这将为宏转录组测序技术的更新发展提供“新”技术,也为病原微生物领域的研究提供更高效的科学研究工具。研究目的本研究的目的是设计一组非完全随机（not-so-random,NSR）引物集合,通过在逆转录过程中对微生物和人类r RNA的特异性脱靶,提高样本中非r RNA序列的占比。特别是在去除人类r RNA的基础上,实现物种非限制性的去除微生物r RNA,从而提高对样本中低丰度微生物的转录定量能力,同时实现简化建库操作步骤和缩短文库构建时间的目的。研究方法本研究通过在随机八聚体引物集合中基于反向互补原则去除匹配上人类和微生物r RNA的引物序列,得到一组长8 nt的非完全随机（NSR8）引物集合作为实验组引物,根据前人研究的方法设计了一对长6 nt的非完全随机（NSR6＿1-NSR6＿2）引物集合作为阳性对照引物,将宏转录组测序技术常用的六聚体随机引物集合作为阴性对照引物;通过使用三组引物进行宏转录组建库测序,分析三组对应的文库数据在人类与细菌的混合模拟样本中非r RNA序列的占比和覆盖情况。研究结果1)本研究设计的NSR8引物能有效降低测序数据中人类r RNA序列占比,在人类编码区高表达基因的覆盖均一性高于两种对照组。2)本研究设计的NSR8引物针对微生物r RNA的去除效率高于完全随机引物和NSR6引物,在肺炎克雷伯菌编码区高表达基因的覆盖均一性高于两种对照组。3)NSR8引物在低质量环境样本的宏转录组建库的文库构建成功率高。研究结论本研究设计的长8 nt的非完全随机（NSR8）引物集合在微量RNA样本的宏转录组建库中能有效去除人与微生物的r RNA,大幅提升人和微生物的有效转录数据占比,并维持转录本覆盖的高均一性。该方法操作简单,文库构建时间由12小时缩短至9.5小时,同时成本有效降低,具备广阔的应用前景。