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mRNA 3’端多聚腺苷酸加尾(3’polyadenylation)是真核生物前体转录本(pre-mRNA)成熟过程中的重要一步,涉及前体转录本的切割(cleavage)和加尾两步酶促反应。切割和加尾反应的位点(polyadenylation site,pA site)则是由前体转录本中的核心和辅助顺式作用元件决定的,这些顺式作用元件又被称为加尾信号(polyadenylation signal,PAS)。核心顺式作用元件AAUAAA是最经典的加尾信号,一般在剪切/加尾位点上游10-30 bp位置。在哺乳动物中,超过50%的基因使用AAUAAA六聚体作为核心加尾信号,超过30%基因使用AAUAAA 1-2个碱基的突变体作为加尾信号,剩余的约有10-20%转录本没有类似于AAUAAA的六聚体加尾信号。另外,哺乳动物中超过50%的基因拥有两个或多个加尾位点,可以在不同的组织、发育时期或环境条件下使用不同的加尾位点,从而产生两个或多个不同的成熟mRNA,这种现象被称为可变加尾(alternative polyadenylation,APA)。尚不清楚这些没有AAUAAA类似六聚体加尾信号的转录本依赖哪种顺式作用元件进行加尾。这三类加尾位点还有很多辅助序列尚未鉴别出来。可变加尾中多个加尾位点是怎么进行选择,核心和辅助序列起到了怎样的作用等都还有待于研究。本研究利用生物信息学分析、流式细胞术、Tet-on系统、双荧光素酶报告系统等技术对上述问题进行了探索。首先,使用生物信息学的方法鉴定了加尾位点中的核心和辅助序列,建立了双顺反子系统用来鉴定加尾位点的顺式作用元件和可变加尾调控。第二,使用双顺反子系统探究了RNA二级结构在加尾位点识别和加尾效率中的作用。最后,探究了转录活性(启动子活性)在加尾效率中的作用。主要结果如下:(1)检索收集了有关猪的EST(expressed sequence tag)数据和二代转录组数据(截止2017.09.01),共计1,676,405条EST数据和3,504,376,496原始reads数据。本研究开发了一套针对大规模转录组数据鉴定RNA加尾位点的流程,鉴定到62,409个加尾位点。这些加尾位点六聚体为:AAUAAA(50.96%);AAUAAA 1-2碱基变体(38.42%);无AAUAAA类似六聚体(10.64%)。其次也分析了可变加尾在猪的转录本中的分布和使用情况,发现76.69%的基因拥有两个或两个以上的RNA加尾位点。(2)构建了双顺反子系统。该系统由双荧光质粒和双荧光素酶质粒组成,其中有统一的框架,1个启动子+第一个开放阅读框(ORF)+2个内切酶位点+1个IRES片段+第二个ORF+1个内切酶位点+1个加尾位点(SV40 pA)+1个内切酶位点。这种双顺反子结构允许在第一个ORF(hRluc或DsRed)后面插入1个加尾位点或顺式作用元件,也可以允许通过酶切位点把第二个ORF(hluc或EGFP)后面的SV40 pA用另一个候选加尾位点或者顺式作用元件代替。与预期的结果一致,哺乳动物细胞转染空载质粒后,空白对照DsRed/EGFP或hluc/hRluc的比值在蛋白和RNA水平上都接近1。当插入一个人工合成的加尾信号(SPA)时,DsRed/EGFP或hluc/hRluc的比值接近0,当插入AAUAAA的1-5个碱基的突变体时,DsRed/EGFP或hluc/hRluc的比值为0-1之间,插入no hexamer和AAUAAA的突变碱基有3个或3个以上的突变时比值都接近0。当双顺反子中分别插入人CD47基因的近端加尾位点(pA1)/远端加尾位点(pA2)或者同时插入两个加尾位点,结果都表明近端pA1比pA2的加尾效率更强。因此,该双顺反子系统不仅可以用于鉴定单个加尾位点或顺式作用元件的加尾效率,也可以用于分析两个可变加尾位点的使用频率。(3)利用生物信息分析预测人基因组上所有基因加尾位点附近的RNA二级结构。结果发现没有AAUAAA类似六聚体的加尾位点附近RNA二级结构最稳定,其次是AAUAAA变体,含有AAUAAA六聚体加尾位点附近RNA二级结构分布最少。荧光素酶的结果表明MS2 RNA二级结构插入到RNA加尾位点上游可促进加尾效率,插入到下游则抑制加尾效率;选取的5个基因加尾位点附近RNA二级结构点突变试验发现,Edf1和Mrpl55基因加尾位点上下游二级结构都促进加尾效率,Actr1b上游二级结构抑制加尾效率,Hotair和Emg1的RNA二级结构对加尾效率无显著影响。这些结果表明许多位于加尾位点上下游100bp内的RNA二级结构起到了辅助顺式作用元件的功能。(4)通过启动子缺失和Tet-on诱导试验研究了转录活性调控SPA及其突变体加尾效率的影响。SV40启动子部分缺失试验表明降低转录活性可以导致加尾效率的降低。相反,增强转录活性会导致加尾效率的提高。加尾位点的加尾效率与转录活性之间呈现很强的正相关性。综上所述,本研究通过生物信息流程的优化鉴定了猪的加尾位点和相关的顺式作用元件,研究了加尾位点附近的RNA二级结构。与前人的研究相比,本研究中得到猪的加尾信号更加准确,并且覆盖度更高。双顺反子系统不仅可以用于鉴定单个加尾位点或顺势元件也可用于检测可变加尾中两个加尾位点的使用频率。在加尾位点附近存在RNA二级结构低分布的现象,RNA二级结构起着辅助元件的作用,降低或者增强加尾位点的加尾效率。此外,转录活性可正调控加尾效率。