目的:研究大分子拥挤环境对不同糖基化程度的黏蛋白(MUC5AC)在复性过程中折叠和聚集的差异效应。方法:首先将含有目的基因片段的重组质粒转染进HEK293细胞诱导MUC5AC的表达,并用镍离子亲和层析柱纯化目的蛋白。用肽N-糖苷酶F(PNGase F)处理纯化的MUC5AC进行酶切去糖基化,聚丙烯酰胺凝胶检测去糖基化结果。利用蛋白拥挤试剂牛血清白蛋白(BSA)以及多糖拥挤剂聚乙二醇2000(PEG2000)、聚蔗糖70(Ficoll70)和葡聚糖70(Dextran70)在体外模拟生物体内的大分子拥挤环境,设置拥挤试剂质量浓度梯度为50g/L、100 g/L和200 g/L,用不含拥挤试剂的缓冲液作为对照组。将盐酸胍(GdnHCl)诱导变性的去糖基化蛋白(d-MUC5AC)及未去糖基化的天然蛋白(n-MUC5AC)分别加入到上述四种大分子拥挤试剂和对照组缓冲液中复性,25℃条件下用紫外分光光度计连续监测复性过程中各组蛋白在488nm处吸光度的变化。复性终产物离心后测定上清液中可溶性蛋白质浓度,分析不同复性体系中蛋白质的复性产率结果:两种蛋白在质量浓度较高(ρ=200 g/L)的拥挤条件下复性产率明显降低,其机制可能是高浓度拥挤试剂可以增加蛋白部分折叠中间体的错误聚集,而在质量浓度相对较低(ρ≤100 g/L)的大分子拥挤试剂中蛋白能很好的复性。同时,在相同浓度的同种拥挤试剂中,d-MUC5AC复性产率均高于n-MUC5AC,而异常聚集的程度则低于n-MUC5AC。结论:细胞内的大分子拥挤环境可不同程度降低MUC5AC的复性产率,并且对加剧糖基化MUC5AC的错误折叠和聚集的影响更显著。