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SPATA4基因是本实验室利用巢式PCR扩增和人类基因组草图搜索法,从人的睾丸cDNA文库中克隆出的新基因。前期研究表明,SPATA4在哺乳动物的睾丸组织中特异表达,并呈现了一定的抗凋亡特性。本课题中,我们主要研究了该基因的启动子结构和功能,另外也对SPATA4蛋白进行了初步纯化分析。首先,在生物信息学预测的基础上,运用SMART RACE技术精确定位了SPATA4基因的转录起始位点,它位于翻译起始密码子上游23bp处。这为我们研究启动子和5’-前导序列的转录调控功能提供了便利。然后,以小鼠血液基因组DNA为模板,克隆出约2.9 kb的启动子序列;并以它为模板,扩增了7个不同片段长度的5’端截短序列,瞬转到TM4细胞中,检测报告基因的荧光活性。结果显示pGL3-P923具有最高的活性,推测其为SPATA4基因启动子的核心片段。另外,生物信息学比对结果表明,在SPATA4基因转录起始位点上游,存在HSF1、RREB1、ZF5等转录因子的结合位点,推测它们对SPATA4基因的启动子活性具有重要影响。通过以上研究,我们初步明确了SPATA4基因启动子的结构和功能,对于分析SPATA4基因的转录调控机制具有重要的指导意义。另外,本研究中构建了SPATA4蛋白的原核表达体系。在目的蛋白的N末端加入麦芽糖结合蛋白(Maltose Binding Protein,MBP),增加了表达蛋白的可溶性。表达蛋白通过磁珠亲和层析进行初步纯化后,采用Resource Q柱离子交换层析和Superdex200柱凝胶过滤层析纯化。电泳结果表明蛋白纯度较高(约95 %),不仅达到了做抗体的纯度要求,而且也为研究该蛋白的晶体结构奠定了基础。