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由指状青霉菌(Penicillium digitatum Sacc.)引起的柑橘绿霉病是采后柑橘最主要病害，目前，化学防治仍然是控制该病害的主要手段，抑霉唑是防治柑橘采后病害的主导药剂，但随着杀菌剂连续多年使用，病菌抗药性问题日益突出，我国个别柑橘产区的防治效果明显下降。因此生产上急需建立一套快速检测柑橘绿霉病菌对抑霉唑抗性的方法，以指导科学用药，提高防治效果。为此，本研究开展了相关工作，取得如下结果：
基于已报道的柑橘绿霉病菌对抑霉唑的抗性分子机制，即I类型CYP51基因启动子区5个126-bp转录增强子的简单串联重复和Ⅱ类型126-bp转录增强子上199-bp的特异性片段插入。设计特异引物T-F55’-CGC ATACTATAC TAC TGG ACTTG-3’(柑橘绿霉病菌特异性上游引物)T-R55’-GTC TTG TTA TTT GGA AAG TGT TAG-3’(柑橘绿霉病菌特异性下游引物)，RT-F25’-CTC ATA CTT CCG ATT CCA GGG A-3’(Ⅰ型抑霉唑抗性菌株特异性上游引物)，199-F25’-GCG GAC CTT GTC ATT ATT TAG AA-3’(Ⅱ型抑霉唑抗性菌株特异性上游引物)，126-R25’-CAC TTG ATC TGC CCT GTT ACC A-3’(抗性菌株通用特异性下游引物)。优化Real-time PCR反应条件，以SYBR Green I为荧光染料在DNA Engine Opticons4(MJ Research.MA.USA)系统中进行real-time PCR扩增。25μL反应体系：12.5μL SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)，模板DNA1μL，正、反向引物(5 mmol/L)各1μL，双蒸水补足至25μL反应条件：95℃预变性2 min；95℃变性20 s，60℃退火25 s，72℃延伸35 s，40个循环，60℃～95℃每0.5℃读取荧光量一次。建立了基于上述三对引物的标准曲线，分别为：Y=-0.2492X+7.39r2=0.997，Y=-0.2526X+6.96r2=0.998，Y=-0.3.087X+7.97r2=0.99，用于样品中各类型抗性菌株DNA的定量检测，并建立了孢子混合液的抗性比例与相应的从real-time PCR得到的抗性DNA比例的线性关系：Y=1.166X-0.029r2=0.990，从而使Real-time PCR的检测值与实际关联起来。最后利用上述建立的方法检测了浙江省柑橘产区金华和丽水2008年采集样品的柑橘绿霉病菌抑霉唑抗性频率，分别为32.89±4.63％和2.60±0.01％。
此外，鉴于已有真菌DNA具有提取方法费时费力、提取质量欠佳、对后续实验带来不良的影响等缺点。本研究以阴离子型氨基酸类表面活性剂N-月桂酰肌氨酸钠(SLS)为主要功能成份，在Saitoh方法的基础上，通过提取方法的改进和提取条件的优化，成功建立了一种适用于多种植物病原真菌的基因组DNA快速提取方法——SLS法。该方法直接以固体培养基上的真菌菌丝为原料，不需物理破碎细胞壁过程，全程提取时间仅需1h。应用该方法能成功提取指状青霉(Penicillium digitatum)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)等多种真菌的基因组DNA，所得DNA浓度、纯度理想，能有效满足限制性内切酶酶切、PCR扩增等分子生物学研究。