肠外致病性大肠杆菌（Extraintestinal pathogenic coli,ExPEC）种类、血清型和毒力因子众多,具有潜在的人畜共患毒力因子,已经对公共卫生造成了一定程度的威胁。且随着抗生素耐药菌的不断产生和蓄积,对细菌感染的治疗带来严峻的挑战。开展禽致病性大肠杆菌（Avianpathogenic Escherichia coli,APEC）的毒力因子的研究对于开发特异性针对ExPEC的预防措施或疗效具有着十分重要的意义。鉴于ExPEC中广泛分布的自转运蛋白在黏附侵袭和免疫逃逸等致病机制方面扮演了重要的角色,这一点提示该类蛋白很可能作为防控ExPEC的潜在靶点,值得探索。其中,温度敏感性血凝素（Temperature sensitive hemagglutinin,Tsh）在 ExPEC 的基因组中广泛存在,有研究表明Tsh作为ExPEC感染畜禽的关键毒力因子发挥黏附和侵袭作用。然而,目前对于ExPEC tsh基因的保守性以及Tsh在人源细胞中的毒力作用尚不明确。因此本研究聚焦ExPEC的Tsh蛋白,利用生物信息学解析tsh在ExPEC中的流行情况,并利用人源脑微血管内皮细胞体外模型探索Tsh在ExPEC的毒力特征。为明确tsh基因在ExPEC中的保守情况,本研究首先利用生物信息学分析了 NCBI数据库中人源、猪源和熊猫源ExPEC大肠杆菌tsh基因序列。随后以禽源性ExPEC的APECIMT5155（CP005930.1）的tsh基因序列为参考序列,设计特异性引物,PCR扩增本实验室的保存的鸡源和犬源ExPEC的tsh基因并测序,将测序结果与上述3株ExPEC的tsh基因进行同源率分析,结果显示,这5株来自不同宿主的ExPEC的tsh基因同源率可达100%,表明ExPECtsh基因在不同宿主中高度保守,说明Tsh蛋白是ExPEC的一种潜在的防控靶点。为进一步探究ExPEC中Tsh蛋白的功能,并为在HBMEC血脑屏障体外模型中探究其毒力特征奠定基础,本研究以本实验室保藏的APEC TW-XM作为代表,利用λ-red同源重组技术构建tsh基因缺失株APECΔtsh,及回补株APECΔtsh/pBR322tsh。细菌生长曲线实验的结果提示Tsh蛋白的缺失对ExPEC的体外正常生长无影响。随后,本研究将野生株APEC TW-XM,缺失株APECΔtsh和回补株APECΔtsh/pBR322tsh分别与HBMEC细胞共培养,通过黏附侵袭实验进一步研究Tsh蛋白在感染人源细胞模型中的毒力作用,结果显示,缺失株APECΔtsh对HBMEC细胞的黏附能力与野生株APECTW-XM、回补株APECΔtsh/pBR322tsh相比显著下降（P＜0.05）,但是在侵袭实验中未见显著差异,表明Tsh蛋白主要在黏附过程中发挥了作用。为了解tsh缺失对黏附作用的影响机制,本研究测定了先前报道的明确会对人和动物的细胞产生致病性的ExPEC毒力因子的表达变化情况,结果显示,tsh基因缺失导致ExPEC关键黏附因子fimH,ibeA,OmpA的表达均发生了极显著下调的情况（P＜0.01）,该结果说明tsh基因缺失介导的黏附作用下调,包括Tsh蛋白的直接黏附作用丧失和下调其他黏附素表达两种途径。在宿主角度分析,本研究测定了 HBMEC细胞相关促炎因子的表达情况,结果显示,Tsh蛋白的缺失导致IL-1β,IL-6的转录水平发生了极显著的下调（P＜0.01）,TNF-α的转录水平发生显著下调（P＜0.05）,提示Tsh蛋白促进了人源细胞HBMEC的炎症反应,推动了细菌性脑膜炎的进程。为了进一步探索Tsh蛋白的黏附致病机制,我们进一步通过Real time PCR测定了人源细胞上Tsh结合蛋白collagen Ⅳ,fibronectin的表达情况,结果显示,Tsh蛋白的缺失导致collagen Ⅳ,fibronectin表达的极显著下降（P＜0.01）,说明Tsh的黏附作用是通过够促进宿主细胞上受体蛋白的表达来实现的。综上,本研究在一定程度上解析了 ExPEC Tsh蛋白对人源细胞的毒力作用机制,即Tsh会诱导宿主细胞结合蛋白collagen Ⅳ,fibronectin的表达,促进ExPEC对HBMEC细胞的黏附,同时介导ExPEC其他毒力因子（fimH,ibeA,OmpA）的上调,继而刺激HBMEC细胞促炎因子IL-1β,IL-6,TNF-α的上调,从而推动细菌性脑膜炎的进程,直接和间接地介导了 ExPEC对宿主的致病过程。另外,本研究证明Tsh蛋白在不同宿主源ExPEC中具有良好的保守性,是一个很有潜力的防控靶点,值得进一步关注和研究。