引言我国是肝炎尤其是乙肝高发国家,肝炎后肝硬化肝癌的发生率较高,肝癌的手术切除治疗具有根治意义。在肝脏相关手术中,通常需要不同程度地阻断肝血流,这就可能会发生肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)。HIRI的发病机制复杂,目前研究认为HIRI由多种因素共同作用导致大量的肝实质细胞功能受损甚至死亡,是手术后肝功能衰竭的重要原因之一,故肝脏缺血再灌注后肝功能的准确预估对临床医生评估患者预后,制定治疗方案,提高患者术后恢复及生存率有一定临床价值。肝功能的评估方法很多,其中基于肝脏去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)显像的肝功能评估方法可以动态观察肝细胞的摄取、代谢、排泄等功能过程,并可以计算功能肝细胞量,被认为是目前正确评估肝功能很有前途的方法。目前较受关注的去唾液酸糖蛋白受体显像剂是99m Tc-GSA,其可与肝细胞膜表面的ASGPR特异性结合而进行肝脏显像,ASGPR的数量和功能与肝细胞的功能呈正相关,通过检测肝细胞ASGPR的数量和活性,可评估肝的功能状况。肝脏发生缺血再灌注损伤时,肝细胞发生不同程度的凋亡和坏死,肝细胞膜表面的ASGPR的数量和活性不同程度地下降,通过ASGPR显像可了解肝功能状况,评估HIRI造成的损伤,以便及时采取治疗措施及评估预后。此外,99m Tc-GSA肝脏SPECT/CT平面加断层显像还可评价区域肝功能,方法为在每个SPECT横断面上划线模拟肝切除,计算剩余或区域肝功能占整体肝功能的比例,该指标可评估肝脏储备功能,预测手术风险,对临床工作帮助很大,但计算操作较为复杂,为了适应临床需要,北京协和医院建立了计算机程序,得到含有肝脏管道解剖结构的三维立体功能影像,可用此程序模拟手术切除,计算出各部分肝脏的功能,使肝功能及区域肝功能的评估方法更具操作性,目前该程序正处于研究完善阶段。本研究通过构建不同程度的兔肝脏缺血再灌注损伤模型,获取肝脏不同损伤程度下的肝酶和病理结果,而后进行99m Tc-GSA兔肝显像实验,获取显像结果,分析显像结果与肝酶和病理结果的相关性,探讨99m Tc-GSA对肝脏缺血再灌注损伤评估的可靠性,为临床应用99m Tc-GSA预测肝脏缺血再灌注损伤以制定合理治疗方案包括手术措施提供理论基础和实验依据。第一部分兔肝缺血再灌注损伤模型的建立目的采用新西兰大白兔制作肝脏不同程度缺血再灌注损伤模型,探讨肝不同缺血时间再灌注后的血清肝酶生化检验指标和组织病理的变化情况,以及术后第3d、第7d上述指标的变化情况,为肝缺血再灌注后99m Tc-GSA肝显像评估肝功能提供病理学基础。材料与方法1.实验动物及分组将体重没有明显差异、雌雄不拘的健康成年新西兰大白兔随机分为A、B、C、D四组,每组8只,设置三个缺血时间段:30min、45min、60min,其中A组设为假手术组,B组为缺血30min组,C组为缺血45min组,D组为缺血60min组,假手术组仅解剖肝十二指肠韧带,不阻断血供。2.兔肝缺血再灌注模型的制作及取材采用无损伤血管夹夹闭兔肝蒂,按照分组分别阻断30min、45min、60min,取出血管夹,恢复肝血流灌注1h后,取肝组织、采血。而后,在术后第3d和第7d对该四组兔子分别进行采血及超声引导下肝脏穿刺取肝组织。3.标本处理(1)血生化,取血后分离血清,测定ALT含量。(2)组织经福尔马林固定后送往病理科进行HE染色观察。4.统计学处理采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。实验所得数据及积分以均数±标准差(±s)形式表示,统计处理采用一般线性模型重复测量方差分析,先进行球形检验分析各组重复测量数据之间是否存在相关性,而后采用相应的方差分析模型,检验标准以P<0.05认为差别有统计学意义。结果1.血清酶学假手术组,ALT基本在正常范围内。缺血再灌注组B、C、D组间比较,术后同一天,D组ALT水平最高,即血流阻断1h组,其次是阻断45min组,最后是30min组。缺血再灌注组组内ALT水平均是阻断血流再灌注1h后最高,术后第3d下降,至术后第7d基本恢复至正常水平,差异有统计学意义。2.肝组织HE病理HE病理结果显示,假手术组及术前肝组织病理形态正常,胞质均匀,核深染;缺血再灌注组肝组织细胞不同程度地被损害,以夹闭60min组损害最重,其次是夹闭45min组,最后是夹闭30min组。缺血再灌注组组内均是夹闭血管再灌注1h后肝细胞损害最重,第3d损害程度有所减轻,至第7d进一步恢复,B组基本恢复至正常水平,差异有统计学意义。结论兔肝缺血再灌注模型制作简单、成功率高,制得的模型随缺血时间的延长,肝酶升高,组织病理损害程度增加,缺血再灌注组再灌注1h损害最重,术后第3d、第7d逐渐恢复,这一梯度病理损害变化过程能很好地满足下一步影像功能研究的需要。第二部分肝脏缺血再灌注损伤99m Tc-GSA显像的实验研究目的结合上述实验动物的肝酶及病理指标变化情况,探讨99m Tc-GSA肝显像评估HIRI后肝功能的价值。材料与方法1.动物分组及HIRI模型的制作实验兔分为假手术组和缺血再灌注组,再灌注组根据缺血时间再分为三组(缺血30min、45min、60min),并在术后第3和第7d继续随访实验。2.99m Tc-GSA的制备及显像参数采用GSA试剂盒,按照文献描述的方法制备99m Tc-GSA并检测放化学纯度,合格后用于显像。对A、B、C、D四组术前、术后1h、术后3d及术后7d分别进行显像。处理显像结果,获得肝脏摄取率(LHL15)与血液清除指数(HH15)。3.血生化及病理检验采血及病理检查见第一部分。4.结果处理分析显像结果,数据的统计学处理同第一部分,将显像结果与血清肝酶及组织病理结果进行对比,采用Pearson相关检验分析相关性。结果1.LHL15缺血再灌注组肝脏摄取率最低的时间点均是T2,即阻断血流再灌注1h后最低,其次是术后3d,术后7d有所恢复,假手术组摄取率基本处正常水平;组间比较,同一时间,D组摄取率最低,即血流阻断1h组,其次是阻断45min组,再次是30min组,假手术组基本处于正常水平。2.HH15组间比较,同一时间,D组HH15最大,即血流阻断1h组,其次是阻断45min组,再次是30min组,假手术组基本处于正常水平;缺血再灌注组显像剂血液清除指数值最大的时间点均是T2,即阻断血流再灌注1h后值最大,其次是术后3d,术后7d减小,假手术组HH15基本处正常水平。3.显像结果与病理及肝酶的相关性分析LHL15、HH15、ALT、HE组织病理评分这四个变量的Pearson相关检验结果示:LHL15与HH15呈高度负相关,r=-0.967,p<0.01;LHL15与HE呈高度负相关,r=-0.957,p<0.01;LHL15与ALT呈高度负相关,r=-0.934,p<0.01;HH15与HE呈高度正相关,r=0.959,p<0.01;HH15与ALT呈高度正相关,r=0.942,p<0.01。即这四个指标彼此高度相关。结论99m Tc-GSA肝显像得到的LHL15、HH15参数与肝酶、组织病理有很好的相关性,能准确反映HIRI后肝损害程度和肝功能的变化。