盐土植物是研究植物耐盐性的重要材料,对于盐土植物耐盐基因的研究可以让我们更加深入了解植物的耐盐机制。例如植物SOS1 (Salt Overly Sensitive 1)蛋白是质膜上已知的唯一的Na+/H+逆转运蛋白,在植物外排钠离子过程中扮演非常重要的角色。同时前人研究证明SpAHA1蛋白可以通过分解ATP产生H+产生跨细胞膜的H+梯度,形成跨膜的电化学势梯度,而SpSOS1蛋白利用这一梯度所产生的能量提高转基因酵母的耐盐性。但是这一理论至今未在植物中得到验证,所以我们在拟南芥中转入SpSOS1、SpAHA1,以及二者,进行后续实验。本实验选取的植物材料海马齿是一种重要的盐土植物,具有极高的耐盐特性,通过扩增盐生植物海马齿中细胞膜Na+/H+逆转运蛋白基因SpSOS1和细胞膜H+-ATPase基因SpAHA1,并同时构建到植物双元表达载体pCAMBIA1304。采用农杆菌介导的方法将植物表达载体转入拟南芥中,利用SpSOS1、SpAHA1基因特异性引物和HygromycinB筛选标记基因引物对抗性苗进行鉴定,获得超表达转基因拟南芥。利用T3代转基因幼苗进行一系列耐盐性分析。并将海马齿SpSOS1蛋白与荧光蛋白GFP融合表达,得到如下结果:1.转SpSOS1基因拟南芥在75 mMNaCl的培养基中发芽率在87.5%以上,明显高于野生型拟南芥的60%。转基因拟南芥幼苗的耐盐性也明显提高,在100mMNaCl条件下能正常生长,具有较高的生物量、根长和侧根数。而野生型拟南芥在50mMNaC1的盐胁迫下明显萎蔫、失绿、甚至死亡。另外土培转基因拟南芥,培养4周后,用200mMNaCl处理10天,观察表型可知盐处理条件下植株长势都减缓,但是转基因拟南芥SpSOS1受到影响较小,叶片长势良好并可以抽苔,完成生育期,而野生型拟南芥已经枯死。测量Na+、K+含量后可知,转基因拟南芥SpSOS1 -1304的Na+升高量和K+的降低量相比于野生型拟南芥缓和很多,总体Na+/K+较高。同时对盐处理后的转基因拟南芥幼苗体内抗氧化酶的活性进行测定,结果表明转基因拟南芥相关酶活性显著提高。2.通过实时定量PCR测量转基因拟南芥相关耐盐基因的表达量,与野生型拟南芥对比可以发现,盐处理后的转基因拟南芥的相关耐盐基因的表达量明显上升,如 AtSOS1、AtSOS2、AtSOS3 等。3.海马齿SpSOS1蛋白与荧光蛋白GFP融合表达后只在细胞膜上观察到荧光信号,在细胞内其他部位没有荧光信号发现,而阳性对照上的荧光在细胞内所有部位都有表达。4.我们发现在50mMNaCl条件下野生型拟南芥枯黄、死亡,SpAHA1转基因苗叶片变黄,相比于单基因转基因苗SpSOS1-1304,SpSOS1-AHA1-1304转基因苗不仅可以在100mMNaCl条件下正常生长,并且拥有更好的长势。同时测量测量拟南芥Na+、K+含量我们也发现SpSOS1-AHA1-1304转基因苗具有相对高的K+和较低的Na+。这些结果表明海马齿SpSOS1蛋白在细胞膜上表达,是细胞膜上的转运蛋白,并且SpSOS1蛋白的存在可以促进拟南芥自身相关耐盐基因表达量得到提升,将植物体内积累的过多的Na+排出防止受到盐害,同时通过激活抗氧化防御系统,调控细胞内Na+/K+平衡,进而提高植物耐盐性。并且我们也发现SpAHA1蛋白可以调节SpSOS1蛋白,为后者提供能量,转入植物中后可以进一步提高转基因拟南芥耐盐性,这一结果在植物体内首次得到验证,为“ATPase酶为转运蛋白提供能量”这一论点提供实验依据。