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鳗鲡肉质鲜美,营养价值高,年出口创汇约7-10亿美元,是我国重要的经济养殖鱼类,但因养殖密度的关系,鳗鲡发病已变得不可避免。研究表明,嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌和创伤弧菌是鳗鲡养殖过程中的常见病原菌。因此,针对单一病原菌的鳗鲡疫苗常常因为保护范围窄、保护率低等原因难以应用于养殖实践。鱼类外膜蛋白的免疫原性研究成为近年鱼类疫苗的研究热点,研究结果表明,同属的病原菌由于外膜蛋白有较高的同源性而能产生交叉保护,但不同属病原菌的外膜蛋白同源性低。因此,在总结本课题组已有相关研究的基础上,本试验拟选取嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌和创伤弧菌表达外膜蛋白膜外区域且抗原决定簇丰富的3个基因片段,设计特异性引物分别扩增,并通过融合PCR技术进行连接。再将该目的片段与表达载体连接,将后者高效表达的三联重组外膜蛋白纯化后免疫鳗鲡,以进行相关的免疫原性探讨,为鳗鲡病原菌三联疫苗的研究奠定基础。主要研究方法与结果如下:1、分别选择创伤弧菌、迟缓爱德华氏菌和嗜水气单胞菌外膜蛋白的OmpU、OmpA和Omp porinП基因,设计特异性引物后分别扩增基因中表达外膜蛋白膜外区域且抗原决定簇丰富的3个基因片段并通过融合PCR技术进行连接。根据表达载体（PGEX-2T-his）的特点,在连接片段的两端引入BamHⅠ和EcoRⅠ两个酶切位点,将3个外膜蛋白基因片段与质粒连接后成功构建了重组表达载体。重组表达载体成功转化大肠杆菌（E.coli BL21）后,当菌液浓度(OD600 nm)为0.8时加入IPTG（终浓度为0.25 mmol/L）,16℃培养5 h后得到了高效表达。表达产物用镍柱洗脱纯化后经梯度尿素复性获得分子质量约85 kD的高纯度三联外膜蛋白。2、为初步研究三联重组外膜蛋白的免疫原性,取195尾日本鳗鲡,平均分为PBS、灭活疫苗和三联外膜蛋白组,分别腹腔注射PBS、三联灭活疫苗或三联重组外膜蛋白疫苗,0.2 mL/尾。分别在14 d、21 d、28 d、42 d和56 d采集鳗鲡的粘液、肾脏和血液进行补体活性、溶菌酶和血清抗体等免疫指标测定。结果表明:免疫14 d后,外膜蛋白组的补体活性显著（P<0.05）高于灭活组。免疫后42 d,灭活菌组和外膜蛋白组血清中溶菌酶均极显著（P<0.01）高于PBS组;14 d时,灭活菌组粘液溶菌酶含量显著（P<0.05）高于外膜蛋白组。21 d时两个试验组肾脏溶菌酶含量均显著（P<0.05）高于PBS组。就抗体效价而言,灭活菌组对3种病原菌的特异性血清抗体均显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）高于PBS组和外膜蛋白组,免疫后28 d,外膜蛋白组对B79的血清抗体显著（P<0.05）高于PBS组。3、为确定三联重组外膜蛋白的免疫原性和免疫保护性,取165尾美洲鳗鲡,平均分为PBS、灭活疫苗和三联外膜蛋白组,对鳗鲡分别腹腔注射PBS、三联灭活疫苗或三联重组外膜蛋白0.2 mL/尾。然后分别在14 d、21 d、28 d和42 d采集鳗鲡的粘液、肝脏、肾脏和血液进行补体活性、溶菌酶、全血细胞培养转化的刺激指数、血清抗体效价等免疫指标检测。结果表明:灭活菌组全血细胞的刺激指数在14 d时显著（P<0.05）高于PBS组。在14 d、21 d、42 d外膜蛋白组的补体活性均高于PBS组和灭活菌组。灭活菌组血清、肝脏和粘液溶菌酶含量均高于或显著（P<0.05）高于PBS组;外膜蛋白组粘液中溶菌酶含量均高于或极显著（P<0.01）高于PBS组。外膜蛋白组和灭活菌组对B11、B79、B88血清效价均显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）高于PBS组。然而,三联外膜蛋白组和灭活菌组对嗜水气单胞菌无免疫保护作用,对迟缓爱德华氏菌的相对免疫保护率分别为70%和60%,对创伤弧菌的相对免疫保护率分别为20%和10%。因此,三联外膜蛋白疫苗可在不程度上刺激鳗鲡的非特异性和特异性免疫系统并显著提高其部分免疫指标,增强或部分增强鳗鲡对爱德华氏菌属和弧菌属细菌感染的抵抗力。