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第一部分心脏干细胞的分离及VEGF对心脏干细胞体外迁移能力的影响目的：比较不同亚型的VEGF对心脏干细胞体外迁移能力的影响及可能的机制。方法：采用免疫磁珠法分选出新生3d大鼠心脏的c-Kit阳性的干细胞。利用RT-PCR鉴定c-Kit阳性的干细胞表达Nkx2.5、GATA4、MEF2C、CXCR4、Flk-1、Flt-1以及neuropilin-1 (NRP-1)的特征；利用荧光免疫细胞化学检测心脏干细胞Nkx2.5、GATA4、Flk-1、Flt-1、NRP-1及CXCR4的表达；利用流式细胞仪分析心脏干细胞的c-Kit阳性的纯度以及CD34、CD45、CD44、CD29、CD90、Flk-1、Flt-1、NRP-1及CXCR4表达的特征；利用免疫细胞荧光化学检测心脏干细胞分化为心肌(αMHC和cTnt)和血管细胞(CD31)的潜能。利用Transwell迁移体系,观察0.1、1、10、20、50、100ng/mL VEGF(VEGF121、VEGF165和VEGF189)对心脏干细胞迁移的影响,随后观察VEGFR阻断剂或P13K/Akt阻断剂wortmannin预处理对心脏干细胞迁移的影响。利用Western Bloting评价VEGF对心脏干细胞pAkt表达的影响。结果：分选获得新生3d大鼠心脏来源的c-Kit阳性的干细胞,纯度为91%,镜下呈现小而圆,核大胞质薄的特征,且呈现出Nkx2.5、GATA4、Flk-1、Flt-1、NRP-1及CXCR4阳性特征,并且能够分化为心肌细胞和血管内皮细胞。体外迁移实验发现不同亚型的VEGF诱导心脏干细胞迁移呈现出剂量依赖的特征,其中VEGF165和VEGF189作用最强,且这个作用与VEGFR1和VEGFR2有关。Western Blotting分析发现VEGF提高了心脏干细胞pAkt的水平,且呈现出时间依赖的特征；PI3K/Akt阻断剂wortmannin (?)能够有效地阻断VEGF所诱导的心脏干细胞迁移效应。结论：从新生大鼠心脏成功分选出c-Kit阳性且呈现出Flk-1、Flt-1、Nkx2.5、GATA4等阳性特征的干细胞；这些心脏干细胞能够分化为心肌细胞和血管内皮细胞；VEGF/VEGFR系统参与了心脏干细胞迁移的过程,此过程与P13K/Akt途径有关。第二部分VEGF诱导心脏干细胞迁移到心梗部位及其修复心脏的作用目的：探索VEGF诱导心脏干细胞迁移到心梗部位修复心脏的作用。方法：心脏干细胞分选方法同第一部分；全骨髓法培养间充质干细胞作为对照,鉴定利用流式细胞仪分析间充质干细胞CD34、CD45、CD29、CD90及c-Kit等表面标记特征,利用成骨成脂肪诱导鉴定其多向诱导分化潜能；在体进行冠状动脉前降支中上1/3处结扎,复制心肌梗死模型；心肌梗死后1周,开胸注射5.0×109pfu腺病毒介导的人VEGF165(Ad.VEGF)或LacZ于心肌梗死部位及周边部位各两个点(每个点50u1),同时于房室沟处注射50ul的2×105 PKH26标记的心脏干细胞,或经VEGFR阻断剂Su5416(5 uM)预处理的心脏干细胞；移植后1周,利用免疫组织荧光化学、ELISA和Western Blotting检测注射的Ad.VEGF在心肌梗死部位的表达特征,利用RT-PCR分析心肌梗死部位过表达VEGF与心肌梗死部位c-Kit和Flk-1表达含量的关系；取心脏切片,荧光显微镜下观察心肌梗死部位及其周边部位PKH26标记的心脏干细胞的数目。处理后1月,利用心导管技术测量心室功能；利用TTC染色评价心肌梗死面积；利用Masson染色评价胶原含量的变化,并测量心室壁厚度的变化以及心室膨胀系数；最后采用免疫荧光组织化学评价心脏成心肌和成血管的能力。结果：流式细胞仪分析全骨髓法培养的间充质干细胞发现CD3、CD45、CD29、CD90及c-Kit等表面标记特征；具备成骨、成脂肪多向诱导分化潜能。在心肌梗死部位注射Ad. VEGF一周后,免疫组织荧光化学定位分析发现在心肌梗死部位高表达人VEGF, ELISA分析发现心肌梗死部位呈现出高浓度的人VEGF,更重要的是,WesternBlotting分析发现注射到心肌梗死部位的Ad.VEGF过表达诱导大鼠内源性VEGF以及SDF-1和HGF的表达。RT-PCR分析心肌梗死部位过表达的VEGF提高了心肌梗死部位c-Kit和Flk-1表达的含量。在体迁移实验发现心肌梗死部位过表达的VEGF诱导注射到房室沟处的心脏干细胞迁移到心肌梗死部位及其周边部位,主要在周边部位,VEGFR阻断剂SU5416明显阻断了VEGF所介导的心脏干细胞在体迁移效应。迁移到心肌梗死部位的心脏干细胞不仅能够分化成心肌细胞和血管内皮细胞,明显增加了心肌梗死部位的毛细血管的密度,而且这种效应部分被SU5416所取消。处理后1月,在体检测各组大鼠心功能发现：Ad.VEGF组、Ad.VEGF+CSCs组、CSCs组及MSCs组左室舒张末期压力(LVEDP)较对照组和Ad.LacZ组明显降低,左室收缩压(LVSP)、±dp/dtmax绝对值较对照组和Ad.LacZ组明显升高,但是均没有恢复到假手术组水平；Ad.VEGF+CSCs组的效果最为显著(LVEDP、LVSP及±dp/dtmax分别是对照组的0.5、1.4和2.1倍)；而且Su5416处理后能部分取消心功能改善的效应。TTC染色发现：Ad.VEGF组、Ad.VEGF+CSCs组、CSCs组及MSCs组与对照组和Ad.LacZ组比较,心肌梗死面积明显减少,均有显著的统计学差异；胶原染色后发现：上述各组与对照组和Ad.LacZ组比较,心室胶原的含量明显减少。此外还发现上述各组与对照组和Ad.LacZ组比较心室壁的厚度明显增厚,左心室膨胀系数明显降低；并且Ad.VEGF+CSCs组与Ad.VEGF组、CSCs组、MSCs组及Su5416组比较,心肌梗死面积、心室胶原的含量以及心室壁的厚度均明显存在差异。结论：VEGF诱导心脏干细胞迁移至心肌梗死部位促进了心肌和血管再生,通过减少了心肌梗死面积、增强心室壁的厚度、减少胶原的含量,从而部分改善了心脏的收缩和舒张功能。第三部分：不同亚型的VEGF对心脏干细胞体外粘附能力的影响目的：探索不同亚型的VEGF对心脏干细胞体外粘附能力的影响及可能的机制。方法：心脏干细胞分选方法同第一部分；粘附实验分析：接种于24孔板培养的人脐静脉内皮细胞,达80—90%融合时,再接种心脏干细胞,观察不同亚型VEGF对心脏干细胞粘附于内皮细胞上能力的影响；利用VEGFR阻断剂、ICAM-1抗体和VCAM-1抗体及PKC阻断剂预处理,观察对心脏干细胞粘附能力的影响。利用流式细胞仪观察VEGF对心脏干细胞ICAM-1和VCAM-1表达的影响,以及VEGFR阻断剂、PKC阻断剂G06976处理后ICAM-1和VCAM-1表达的变化。结果：体外粘附实验发现VEGF诱导心脏干细胞粘附也呈现出剂量依赖的特征；其中VEGF165作用最强,且这个作用与VEGFRl和VEGFR2有关。VEGF165明显增加了心脏干细胞VCAM-1的表达,其效应能被PKC所阻断,且VEGF165介导的心脏干细胞粘附效应能够被VCAM-1抗体和PKC阻断剂所取消。结论：VEGF/VEGFR系统参与了心脏干细胞粘附内皮细胞的过程,且这个过程与PKC/VCAM-1途径有关。第四部分VEGF诱导心脏干细胞粘附驻留在心梗部位的作用目的：探索VEGF对心脏干细胞在体粘附驻留在心梗部位的影响。方法：心脏干细胞分选方法同第一部分：在体采用冠状动脉前降之中上1/3处结扎复制心肌梗死模型。心肌梗死后1h,心梗部位注射VCAM-1抗体、PKC阻断剂预处理的2×105PKH26标记的心脏干细胞,3d后处死大鼠,收集心脏,共聚焦荧光显微镜下观察并计数心梗部位PKH26阳性的心脏干细胞数目。结果：在体粘附实验发现VEGF165处理的心脏干细胞注射3d后,在心梗部位的心脏干细胞数目和含量明显增多,且能被VCAM-1抗体和PKC阻断剂所取消。结论：VEGF促进了心脏干细胞粘附聚集在心梗部位,且这个过程与PKC/VCAM-1途径有关。