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大量的研究表明,JAK/STAT信号通路作为非特异性免疫系统的重要组成,在脊椎动物抗细菌活动中起着关键的作用。JAK激酶是一种非受体型络氨酸激酶,在哺乳动物中,已被证实是参与干扰素或白介素介导信号传导的关键蛋白。团头鲂(Megalobrama amblycephala)是我国重要的淡水养殖鱼类之一,但由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)引起的细菌性败血症严重影响了其经济效益。为了探究团头鲂JAK家族基因是否参与团头鲂感染嗜水气单胞菌后的免疫过程,本研究以团头鲂为对象,克隆鉴定了5个团头鲂JAK家族基因的ORF序列,并对其进行生物信息学分析;通过实时荧光定量PCR技术对团头鲂JAK家族基因在健康成鱼组织和感染嗜水气单胞菌后免疫相关组织中的表达进行了分析;利用Western-blot技术检测MamJAK1磷酸化蛋白在团头鲂感染嗜水气单胞菌后,在脾脏和中肾中的表达变化;之后,使用LPS刺激草鱼CIK细胞后,检测IL-6R和JAK1基因的表达,以及JAK1蛋白磷酸化表达;最后,构建真核表达载体p EGFP-IL-6R转染到草鱼CIK细胞中,检测JAK1磷酸化蛋白的表达变化。这些研究结果为进一步研究团头鲂JAK/STAT信号通路打下基础,也将为团头鲂的抗病育种工作提供理论依据。本研究主要结果如下:1.团头鲂JAK家族基因的序列分析团头鲂JAK家族基因MamJAK1、MamJAK2a、MamJAK2b、MamJAK3、Mam TYK2的ORF序列长度分别为3462 bp、3321 bp、3378 bp、3042 bp和3489bp,分别编码1153、1106、1125、1013和1162个氨基酸。氨基酸多序列对比结果显示,团头鲂JAK家族基因保守性较高,均具有B41、SH2、STyr Kc和Tyr Kc蛋白结构域,且它们的磷酸化位点高度保守。系统进化分析结果显示,鱼类的JAK1、JAK3和TYK2分别聚为一支,此外,鱼类JAK2a聚为一支,鱼类的JAK2b和哺乳动物的JAK2聚为一支。2.团头鲂JAK家族基因的表达团头鲂JAK家族基因在10个健康组织中均有表达,除MamJAK1外,其余基因在组织中的表达量差异较大。MamJAK1在血液和脾脏中表达量最高,其次是肠和中肾,在脑和心脏中的表达量最低;MamJAK2a在中肾中表达量最高,其次是血液和脾脏,在脑和肌肉中的表达量最低;MamJAK2b在血液中的表达量最低,其次是中肾和脾脏,在心脏和肌肉中表达量最低;MamJAK3在血液中表达量最高,其次是中肾和脾脏,在肝脏和肌肉中的表达量最低;Mam TYK2在中肾中的表达量最高,其次是血液和脾脏,在肝脏和肌肉中的表达量最低。由此可见,JAK家族基因在血液、中肾和脾脏中的表达量较高,在肌肉和脑中的表达量较低。感染嗜水气单胞菌后,团头鲂JAK家族基因在免疫相关组织中的表达均有显著性变化,但不尽相同。MamJAK1在脾脏和中肾中,感染后4、24 h的表达上调,且在24 h极显著上调并到达峰值;在肠中,4 h极显著上调并到达峰值,24 h显著下调。MamJAK2a在脾脏和中肾中,12 h和24 h表达上调,24 h到达峰值;在肠中,12 h和120 h表达显著下调。MamJAK2b在脾脏和肠中分别在24h和12 h显著上调且到达峰值,在肠中4 h、120 h和在脾脏中24 h显著下调。MamJAK3在中肾中12 h显著上调,24 h显著上调并到达峰值;在脾脏中,12 h极显著上调并到达峰值,4 h和24 h显著下调;在肠中,4 h和24 h显著下调,在72 h则极显著上调。Mam TYK2在脾脏、肾脏和肠中有相似的表达模式:在12h显著上调并达峰值,其它时间点则显著下调。MamJAK1蛋白磷酸化水平与m RNA水平相似:在中肾中,p MamJAK1在12 h和24 h高于其他时间点,且24 h最高;在脾脏中,p MamJAK1在24 h和72 h高于其他时间点,且24 h最高。3.LPS刺激和IL-6R过表达促进JAK1蛋白磷酸化LPS刺激草鱼CIK细胞后,IL-6R和JAK1的m RNA表达趋势相似:IL-6R在24 h极显著上调达到最大值;JAK1在3 h极显著上调,在36 h极显著上调并达到最大值。JAK1蛋白磷酸化水平和其m RNA的表达类似,在24 h和36 h明显高于其他时间点的表达量,且在24 h的表达量最大。将真核表达载体p EGFP-IL-6R转染到草鱼CIK细胞,转染效率较好,结果表明过表达IL-6R能够促进JAK1蛋白的磷酸化水平。