骨化三醇对大鼠牙龈上皮细胞自噬及炎症的影响

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目的:本研究目的是了解骨化三醇(1,25-二羟维生素D3,1,25(OH)2D3,以下简称1,25D)对牙周炎大鼠牙龈上皮细胞中自噬及炎症的影响,并进一步了解自噬在1,25D调节大鼠牙周组织炎症及感染中发挥的作用。方法:选8周龄SD雄性大鼠9只,体重220±20 g。将9只大鼠随机分为A,B,C三组(空白溶剂组,低浓度1,25D组及高浓度1,25D组),每组3只,分笼饲养。定义非牙周炎侧为N侧,牙周炎侧为P侧,则大鼠牙周组织分为A-N,A-P,B-N,B-P,C-N,C-P。将9只大鼠用2%戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔注射麻醉。将大鼠左侧上下颌第一磨牙牙龈和牙根面分离,然后用正畸结扎钢丝结扎牙颈部,颊侧打结,并使结扎钢丝尽量推进龈沟内。从结扎后1周开始,隔日口腔接种牙龈卟啉单胞菌1次,共接种5次。结扎4周后去除结扎钢丝。以丙二醇:水:乙醇=60:30:10的比例制作溶剂,A,B,C三组大鼠分别每天腹腔注射空白溶剂0.2 ml、0.2μg/kg(1,25D/大鼠体重)溶于溶剂0.2 ml以及2μg/kg(1,25D/大鼠体重)溶于溶剂0.2 ml,连续给药1周。给药结束后处死大鼠。迅速切取并分离双侧上、下颌骨,生理盐水冲洗后固定。观察如下指标:(1)大体标本及HE染色观察组织炎症情况;(2)免疫组织化学染色法检测BECN-1,ATG7,LL-37表达;(3)免疫荧光法检测LC3表达;(4)免疫组织化学染色法检测IL-1β,IL-6表达。(5)采集大鼠尾静脉血,甲基百里香酚蓝(MTB)比色法测定大鼠血清钙离子浓度。结果:(1)在A,B,C三组中,A-P,B-P,C-P比A-N,B-N,C-N中的ATG7,BECN1和LC3,LL-37表达增加,且差异具有统计学意义。(2)大鼠注射1,25D后,牙龈上皮细胞ATG7的表达B-P组和C-P组均高于A-P组(P=0.004,P=0.0001),且C-P组表达高于B-P组(P=0.003);B-N组和C-N组均高于A-N组(P=0.0001,P=0.001),但C-N组与B-N组差异无统计学意义(P=0.074)。牙龈上皮细胞BECN1的表达B-P组和C-P组均高于A-P组(P=0.005,P=0.001),但C-P组与B-P组差异无统计学意义(P=0.233);B-N组和C-N组均高于A-N组(P=0.0001,P=0.0001),但C-N组与B-N组差异无统计学意义(P=0.051)。牙龈上皮细胞LC3的表达B-P组和C-P组均高于A-P组(P=0.003,P=0.0001),且C-P组表达高于B-P组(P=0.006);B-N组和C-N组均高于A-N组(P=0.001,P=0.0001),且C-N组表达高于B-N组(P=0.001)。牙龈上皮细胞LL-37的表达B-P组和C-P组均高于A-P组(P=0.0001,P=0.0001),且C-P组表达高于B-P组(P=0.009);B-N组和C-N组均高于A-N组(P=0.003,P=0.0001),且C-N组表达高于B-N组(P=0.018)。(3)牙龈上皮细胞IL-1β及IL-6的表达A-P>B-P>C-P>A-N。(4)大鼠注射1,25D后B组血清钙浓度平均上升0.16mmol/L(P=0.012),C组血清钙浓度平均上升0.14mmol/L(P=0.018),但B组与C组间血清钙的上升差异无统计学意义(P=0.286)。结论:1.实验性牙周炎促进大鼠牙龈上皮细胞自噬反应。2.1,25D促进大鼠牙龈上皮细胞的自噬反应。3.1,25D可在一定程度上缓解大鼠牙龈上皮细胞的促炎性细胞因子的产生并且1,25D对促炎性细胞因子的抑制作用呈现浓度依赖性。
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