论文部分内容阅读
目的:研究去乙酰化酶Sirt1对B[a]P诱导的支气管上皮细胞炎性反应中TNF-α表达的调控作用和调控机制，以及对细胞迁移和侵袭的影响。 背景:沉默信息调节因子1(Silent information regulator1，Sirt1)是一个具有尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+依赖性的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，它可以使组蛋白和非组蛋白因子发生去乙酰化，从而调控细胞衰老、细胞凋亡、能量代谢、DNA修复以及细胞凋亡等生命过程。人类Sirt1通过调控细胞的存活以及能量代谢过程中等多种机体的生理以及病理性过程，从而参与了多种人类疾病如肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病等的发生、发展。肿瘤坏死因子TNF-α是一种主要由单核巨噬细胞、淋巴细胞产生的细胞因子，它具有多种生物学功能，在细胞凋亡、生存、炎症反应和免疫防御等方面都发挥了重要的作用，是炎症反应过程中出现最早、最重要的炎性介质。由于炎症环境能够促进肿瘤细胞的侵袭和转移，因此炎症的持续存在与癌症的形成之间存在紧密联系。同时，Sirt1可以和多种细胞因子相互作用对机体产生不同的影响，其中就包括有肿瘤坏死因子TNF-α，在炎症过程和肿瘤的发生发展过程中起着重要的作用。本研究是在苯并芘B[a]P暴露下，Sirt1基因对肿瘤坏死因子TNF-α的调节作用及其调节机制的初步探索。 方法: 1.Western Blot蛋白质印迹技术检测Sirt1蛋白的表达水平 提取Beas-2B细胞的总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，然后采用Western Blot检测Sirt1蛋白表达情况。 2.Real-time PCR鉴定Sirt1 mRNA的表达 提取Beas-2B细胞的总RNA，NANO DROP2000测定RNA浓度，逆转录后通过Real-time PCR检测Sirt1 mRNA的表达情况。 3.质粒转染 将Sirt1基因过表达质粒、Sirt1基因沉默质粒和相对应的空载体采用脂质体转染法转染到人支气管上皮细胞（Beas-2B）中，采用Western Blot蛋白质印迹技术鉴定转染效果，加抗生素筛选出Beas-2B-pcDNA3.1、Beas-2B-Sirt1-overexpression、Beas-2B-pGPU6、Beas-2B-Sirt1-shRNA稳定转染细胞株。 4.Real-time PCR检测炎症因子TNF-α mRNA的表达 提取Beas-2B-pcDNA3.1、Beas-2B-Sirt1-overexpression、 Beas-2B-pGPU6、Beas-2B-Sirt1-shRNA稳定转染细胞株的总RNA，NANO DROP2000测定RNA浓度，逆转录后通过Real-time PCR检测TNF-α mRNA的表达情况。 5.构建质粒 根据UCSC Genome Browser网站数据库检索获得的TNF-α启动子序列设计引物，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段，然后将目的片段和载体进行双酶切，连接后转入E.coli DH5α感受态细胞，提取质粒。将质粒双酶切鉴定，同时送公司进行DNA测序。 6.双荧光素酶活性检测 将构建成功的TNF-α启动子双荧光素酶报告基因重组质粒采用脂质体转染法转染到Beas-2B-pcDNA3.1、Beas-2B-Sirt1-overexpression稳定转染细胞株中，采用双荧光素酶报告系统检测Sirt1对TNF-α转录活性的调控。 7.Transwell细胞迁移实验检测细胞的迁移能力。 8.Transwell细胞侵袭实验检测细胞的侵袭能力。 结果:在Beas-2B细胞中，经8uM苯并芘B[a]P刺激后Sirt1的蛋白质水平和mRNA水平均升高。和Beas-2B-pcDNA3.1稳定转染细胞相比，在Beas-2B-Sirt1-overexpression稳定转染细胞中，经8uM苯并芘B[a]P刺激细胞后TNF-α mRNA表达升高，而且细胞迁移能力和侵袭能力也增加。和Beas-2B-pGPU6稳定转染细胞相比，在Beas-2B-Sirt1-shRNA稳定转染细胞中，经8uM苯并芘B[a]P刺激后TNF-α mRNA表达水平的升高程度降低，同时细胞迁移能力和侵袭能力也相应减弱。成功构建的TNF-α启动子双荧光素酶报告基因重组质粒转染Beas-2B-pcDNA3.1和Beas-2B-Sirt1-overexpression稳定转染细胞发现，TNF-α启动子双荧光素酶活性的变化和TNF-α mRNA水平变化一致，可以得出Sirt1通过调控TNF-α的转录活性来调节TNF-α mRNA表达量的变化。 结论: Sirt1的表达量增高，能够通过促进TNF-α的转录活性来促进TNF-αmRNA的表达，同时促进Beas-2B细胞的迁移和侵袭;相反的，Sirt1的表达量降低抑制TNF-α mRNA的升高程度，进一步抑制Beas-2B细胞的迁移和侵袭。